新型CRISPR/dCas9引导的Fok I核酸酶靶向破坏bcr-abl基因清除CML致病根源

In the clinical treatment of chronic myeloid leukemia，resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKIs) and recurrence caused by leukemia stem cells (LSC) which are insensitive to TKIs are the key defects which need further solutions. The bcr-abl fusion gene is not only the primary pathogenesis of CML, but also the origin of resistance and recurrence. Therefore, a method eliminating the bcr-abl fusion gene will fundamentally solve the clinical TKIs resistance and recurrence problem. In this project, we plan to design a mutation modified CRISPR/dCas9 system guided Fok I nuclease aiming to combine with bcr-abl with high efficiency and specificity which will lead to a DNA double stranded break in bcr-abl target sequence and start cellular DNA repair procedure comprised of homology directed repair (HDR) and non homologous end joining (NHEJ), which then induce bcr-abl gene frame shift mutation, resulting in disruption of bcr-abl locus and resultant elimination of the pathogenic origin of CML. This project is expected to solve the clinical TKIs resistance and recurrence problem, and provide an alternative therapy for CML patients, especially for the ones response poorly to TKIs and recurrent.

慢性粒细胞白血病（CML）的临床治疗面临酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）耐药、白血病干细胞（LSC）对TKIs不敏感，残留LSC致疾病复发等难题，亟需探索根治CML的方法。bcr-abl融合基因是CML的发病根源，也是耐药、复发的根源，因此，探寻能够清除bcr-abl融合基因的方法将有可能从根本上解决临床耐药、复发问题。本项目拟利用突变修饰的CRISPR/dCas9系统引导的Fok I核酸酶定点修饰靶基因的原理，构建高效、特异结合bcr-abl基因的CRISPR/dCas9-Fok I核酸酶，促发bcr-abl DNA双链断裂，启动细胞自身的同源定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）修复机制，人工诱导bcr-abl基因移码突变，达到彻底破坏bcr-abl基因组，清除CML的致病源动力，解决耐药和复发难题的目的。本项目有望为CML患者，尤其是TKIs疗效差和复发的患者提供一种替代疗法。

慢性粒细胞白血病（CML）的临床治疗面临酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）耐药、白血病干细胞（LSC）对TKIs不敏感，残留LSC致疾病复发等难题，亟需探索根治CML的方法。bcr-abl融合基因是CML发病、耐药、复发的根源，因此，探寻能够清除bcr-abl融合基因的方法将有可能从根本上解决临床耐药、复发问题。本项目拟利用突变修饰的CRISPR/dCas9系统引导的FokI核酸酶定点修饰靶基因的原理，构建高效、特异结合bcr-abl基因的FokI-dCas9系统，促发bcr-abl DNA双链断裂，启动细胞自身的同源定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）修复机制，人工诱导bcr-abl基因移码突变，达到彻底破坏bcr-abl基因，清除CML的致病源动力，解决耐药和复发难题的目的。因此本课题设计并构建特异识别结合bcr-abl 保守区的gRNA表达质粒，将gRNA和FokI-dCas9共同构成的RFNs联合donor转导CML细胞，RFNs特异性结合到bcr-abl靶位点，促发bcr-abl DNA双链断裂，在供体DNA中引入8个碱基的NotI酶切位点，断裂的bcr-abl以供体DNA为模板，进行HDR。本课题证实了RFNs能有效切割bcr-abl，并成功插入NotI酶切位点，导致bcr-abl框移突变，提前遇到终止密码子从而终止转录BCR-ABL。在体外实验中证实，无论是在伊马替尼敏感的K562细胞株或者耐药株K562/G01中，还是在CML病人CD34+细胞中，RFNs均能抑制bcr-abl+细胞的增殖并促进其凋亡。在体内实验中，RFNs能抑制CML细胞的白血病生成能力。本课题的研究结果将为RFNs用于CML基因治疗提供实验支撑，并有望为TKIs疗效差的CML患者提供一种潜在的新疗法，同时为核酸酶修饰技术在基因治疗领域的应用提供参考价值。