应用60Co-γ射线诱变技术筛选高含油微藻突变株及有机废水的暗发酵产氢-微藻产油耦合产能系统的构建

Biodiesel and bio-hydrogen are renewable and environmentally friendly "green energy", and meet the strategic demands of energy conservation, emission reduction and low-carbon economic development in the 12th national five-year plan. Traditional methods have some disadvantages such as long period, small probability, unstable genetic traits and degeneration in the selection of excellent microalgae with, as well as high cost of energy production and low treatment efficiency and energy recovery rate from organic wastewater. So this subject plans to gain microalgae mutants with strong environmental adaptability, fast growth rate and high lipid content through 60Co-γ induced mutation technique, as well as find and obtain the key genes affecting lipid synthesis and expression via molecular bio-techniques. In addition lipid-producing conditions are optimized to construct effective regulation strategies for lipid production. Finally, this subject intends to construct the combination system of dark-fermentation hydrogen production and microalgae biodiesel production and to achieve step-by-step conversion and high efficient energy recovery from organic wastewater. This work will make positive contributions to solve energy shortage, increase energy recovery rate and reduce environmental pollution.

生物柴油和生物制氢是新型"绿色能源"，具有可再生和环境保护的双重功效，符合国家"十二五"规划节能减排和低碳经济发展的战略需求。针对传统方法选育微藻存在的周期长、几率小、遗传性状不稳定、藻种退化等不足，以及能源生产成本高，有机废水的处理效率和能源回收率低等瓶颈问题，本课题拟通过60Co-γ射线诱变育种技术获得环境适应能力强、生长迅速、高含油微藻突变株，通过分子生物学诊断技术发现并获得影响油脂合成和表达的关键基因，优化产油条件，建立有效的油脂生产调控策略，并探索微生物产氢产油耦合的技术方法，建立耦合系统适配模式，实现废水中有机物的梯级转化与深度产能，为解决能源短缺、提高能源回收率、降低环境污染做出积极贡献。

针对传统方法选育微藻存在的周期长、几率小、遗传性状不稳定、藻种退化等不足，以及能源生产成本高，有机废水的处理效率和能源回收率低等瓶颈问题，本课题通过60Co-γ射线诱变育种技术获得环境适应能力强、生长迅速、高含油微藻突变株，通过分子生物学诊断技术发现并获得影响油脂合成和表达的关键基因，优化产油条件，建立有效的油脂生产调控策略，并探索微生物产氢产油耦合的技术方法，建立耦合系统的适配模式。.本课题的主要研究成果如下：(1) 通过对剂量范围的两次优化，野生微藻Scenedesmus. MC-1经60Co-γ射线诱变后，筛选到一株富油微藻Scenedesmus. Z-4，相比于出发藻株其油脂含量和生物量分别提高了约40%和18%。(2) 采用间歇培养实验对突变藻株的生长和产油条件进行了优化，最佳条件为葡萄糖10 g/L，硝酸钠0.8 g/L，磷酸二氢钾0.04 g/L，pH值7.0-7.5，光暗周期比12:12，油脂含量和生物量高达38.5%和3.9 g/L。(3) 突变藻细胞的体积更大、对底物的利用率更高、生长速率及产油速率更快，这些可能是其油脂能够高效积累的原因之一。(4) 利用PCR-RFLP技术对油脂合成中的关键基因—ACCase基因和PEPCase基因进行了差异分析，经鉴定突变藻株在ACCase基因的318bp和456bp处、PEPCase基因的117bp处分别发生了点突变，这些基因的改变可能也影响了两种酶的活性。（5）构建了暗发酵细菌和微藻耦合产能工艺体系。以葡萄糖和不同类型的淀粉为底物，哈尔滨产乙醇杆菌B49（Ethanoligenens harbinense B49）和混合菌种分别被用于暗发酵阶段来生产氢气，暗发酵废液中的末端代谢产物主要是乙酸和丁酸/乙醇，这些产物被栅藻R-16进一步用于生长和油脂积累。在混合菌种和微藻一步法产能体系中，混合比例、淀粉浓度和初始pH对产氢和油脂积累有重要作用，一步法体系可消耗多数制氢过程产生的代谢产物。与暗发酵制氢相比，耦合体系可显著提高系统的能源转化效率。此外，对暗发酵制氢和一步法体系的群落结构进行了分析。.本项目能够实现废水中有机物的梯级转化与深度产能，为解决能源短缺、提高能源回收率、降低环境污染做出积极贡献，具有很好的社会影响和应用价值。