低等蟹类肢孔派的进化线粒体基因组学研究

Brachyura, the true crabs, is the largest clade of the decapod Crustacea. They are generally divided into two major groups: Eubrachyura or 'advanced' crabs, and Podotremata or 'primitive' crabs. The status of Podotremata is one of the most controversial issues in brachyuran systematics. In this project, more than fifty complete mitochondrial sequences of the crab species will be obtained by the methods of mitochondria isolation, long-PCR amplification, construction of small fraction library and DNA sequencing. The data representing all the families of primitive crabs and their related clades will be collected. Under maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian inference, the status of Podotremata (whether mono-, para-, or polyphyletic) will be revealed. Combined with nuclear DNA, the taxa of Dromioidea and Raninoidea will be elucidated. The mitochondrial sequences of special species in China will supply the important genetic information for biological diversity. This study will proceed the mitochondrial genome of marine crabs.

短尾次目（Brachyura）是真正的蟹类、甲壳动物最高等的类群，大部分生活在海洋中。有关蟹类的起源与系统进化已争论了上百年，线粒体基因组学的兴起为解决这一争论提供了契机。本项目通过线粒体分离、Long-PCR扩增、小片段文库构建、DNA测序等技术获取50种以上线粒体基因组全序列（mtDNA），采用最大简约法、最大似然法和贝叶斯分析法，对包括新测序列在内、涵盖现存低等蟹类所有总科及其起源相关类群的mtDNA全序列进行分析，阐述低等蟹类线粒体基因组的结构特征，同时结合核基因编码蛋白NaK和PEPCK的核苷酸数据，重点揭示肢孔派的进化模式，明确绵蟹总科和蛙蟹总科的分类地位。我国特有海洋蟹类mtDNA全序列的测定，为世界海洋蟹类资源提供独特的遗传多样性数据。本项目将填补这一研究领域的国际空白，为揭示蟹类的起源和进化提供宝贵的遗传信息，大大推进海洋蟹类线粒体基因组学的研究。

本项目完成了研究计划的预期目标，有些指标超额完成。研究对56种低等蟹及其起源相关物种线粒体基因组全长序列进行了分析，其中37个来源于GenBank，19个为自主测序并已在GenBank释放。已完成的研究包括低等蟹线粒体基因组结构特征、基因重排机制、短尾类各亚目的系统发育关系分析等，阐明了绵蟹总科和蛙蟹总科的分类地位。已发表SCI论文4篇，正在整理和投稿的SCI论文8篇；完成培养硕士研究生4人、博士研究生1人；参加和组织学术会议及学术交流活动6次。. 以研究获得的毛刺贝绵蟹、大摩罗蟹、东方人面蟹、马来似人面蟹、东方乌氏蟹和短额琵琶蟹的线粒体基因组为例，全长在15,466-16,475 bp 之间，均包含37个基因（13个蛋白编码基因、2个rRNA和22个tRNA基因）。与泛甲壳动物相比，低等蟹trnH均转移至trnE和trnF之间，且在毛刺贝绵蟹中，还存在trnQ和CR区的重排，这种重排可能是由部分序列发生重复并伴随着随机不完全删除造成。与大多数短尾类不同，毛刺贝绵蟹有多个长的非编码区，且位于trnL1和trnQ之间的非编码区为其控制区；人面蟹控制区中均存在重复单元和次数不同的重复序列，导致其控制区长度差异明显。蛋白编码基因中，第三位密码子呈现强烈的AT偏好性；大部分基因以ATN为起始密码子，而ATP8和nad1中为GTG；与真短尾类不同，低等蟹cox1基因均以ACG为起始密码子；其中nad1、4、5进化速率相对较快可作为备选标记用于后续系统发育研究。低等蟹大部分tRNA基因可折叠成四叶草结构；而东方乌氏蟹、毛刺贝绵蟹和大摩罗蟹trnS2缺失了二氢尿嘧啶（DHU）臂，在人面蟹中存在碱基缺失的DHU臂；trnI仅在短额琵琶蟹中缺少DHU臂，此现象在短尾类中首次出现。系统发育结果表明：歪尾类和短尾类互为单系群；毛刺贝绵蟹和人面蟹亲缘关系更近，位于短尾类系统发育树底部，支持绵蟹亚派的分类系统；人面总科和蛙蟹总科均为单系发生；蛙蟹与真短尾类互为姐妹群，支持肢孔派为并系发生。以上结果为揭示蟹类起源和进化提供了宝贵遗传信息，为解决短尾类乃至甲壳动物的分类及系统发育争议提供了重要参考。