研究激酶NUAK1的新功能：调控mTOR信号通路

NUAK1是LKB1的激酶底物之一，但其在LKB1相关信号通路中的功能尚不清楚。我们的前期研究表明：经LKB1激活的NUAK1与tuberin免疫共沉淀并可能直接磷酸化tuberin。已有研究证实tuberin可调节mTOR通路并调控翻译和细胞生长，我们因此提出假说："激酶NUAK1可能通过与tuberin的直接相互作用介导LKB1对mTOR通路的调节，从而调控蛋白质合成与细胞生长"，围绕NUAK1在LKB1相关信号通路中的新功能展开研究。拟用in vitro和in vivo蛋白磷酸化检测、RNAi、免疫荧光检测和7-methyl GTP pull-down等技术手段回答以下问题：在LKB1相关信号通路中NUAK1是否通过直接磷酸化tuberin调控mTOR通路？该调控对翻译和细胞生长有何影响？从而深入探讨LKB1/NUAK1调控mTOR通路的机制，揭示NUAK1在细胞信号网络中的新功能

NUAK1是多功能抑癌蛋白LKB1的激酶底物之一，但目前对其在LKB1相关信号通路中的作用缺乏了解。本项目研究激酶NUAK1在LKB1相关信号通路中的新功能，即： NUAK1通过与tuberin的直接相互作用介导LKB1对mTOR通路的负调控。.研究发现：.1.在in vitro磷酸化实验中，经LKB1激活的野生型NUAK1对tuberin有明显的磷酸化功能，而不能被LKB1磷酸化激活的突变体则丧失这种活性。.2.在in vivo磷酸化实验中，过表达NUAK1可显著提高tuberin的磷酸化水平，而抑制NUAK1的表达或活性则降低tuberin的磷酸化水平。.3.免疫共沉淀实验显示：经LKB1激活的NUAK1激酶在细胞质中与tuberin蛋白结合。上述研究结果表明NUAK1可以直接磷酸化tuberin蛋白。.4.在lkb1-/-细胞中重建LKB1的活性可显著提高tuberin的磷酸化水平，共转染NUAK1可进一步提高磷酸化水平，而抑制内源NUAK1则会明显降低tuberin的磷酸化。.5.tuberin蛋白磷酸化水平的提高伴随着mTOR通路的下调。上述数据表明LKB1对tuberin和mTOR通路的调控依赖于NUAK1的激酶活性。.6.NUAK1对tuberin的in vitro磷酸化位点包括Ser981、Ser1132、Thr1330和Ser1387，而in vivo磷酸化则只有Thr1330和Ser1387两个位点。.7.在lkb1-/-的细胞中重建LKB1的表达可以显著下调mTOR通路,而抑制tuberin的内源表达或者转染tuberin的磷酸化位点突变体均可拮抗LKB1对mTOR通路的负调控。.8.实验7中mTOR通路的下调与细胞增殖抑制高度相关，且导致细胞周期阻滞在G1/S边界。上述结果表明LKB1/NUAK1对mTOR通路的调控依赖于tuberin在特定位点的磷酸化，且通过对mTOR通路的负调控抑制细胞增殖。.9.PJS相关性肠道肿瘤患者正常组织中的LKB1与NUAK1活性均为肠道肿瘤组织的约5倍， 肿瘤组织中mTOR通路因子的磷酸化水平显著上调。.本项目研究在国际上首先发现激酶NUAK1的新功能，即通过直接磷酸化tuberin而介导LKB1对mTOR通路的负调控，从而抑制细胞生长和增殖。