基于mER的人工质膜对几种典型EEs雌激素效应作用机制研究

环境雌激素（EEs）可与体内受体结合影响人体生殖发育，导致癌症等多种疾病。目前EEs污染已对人类的生存和发展形成潜在威胁,但EEs对生物体的作用机制尚未十分清楚。基于膜受体(mER)的环境雌激素效应复杂多样，本项目从mER与EEs作用之初对膜的影响入手，以双酚A、雌二醇等典型EEs为代表，利用人工质膜探索mER与EEs的作用机制。通过天然电活性物质和连接蛋白筛选，以mER为功能元件，分子自组装构建具有mER活性的人工质膜，SPR考察其效果及动力学参数；通过模拟活体细胞膜mER和EEs识别，结合膜片钳及荧光标记技术，研究mER与EEs响应对膜的微观重构作用；透射电镜、MALDI-TOF及重组酵母培养实验评价人工质膜的离体模拟效果。该模型的成功构建有助于进一步阐明mER介导的环境雌激素效应作用机制，并弥补现有环境污染物雌激素效应评价方法的不足，为逐步认识和预防EEs对人体的危害提供科学依据。

项目以典型环境雌激素双酚A ，雌二醇为代表，以膜受体（mER）为功能元件，构建了具有生物活性的人工质膜模型，研究了双酚A ，雌二醇对该体系的响应，通过重组人雌激素受体基因酵母菌双杂交体系验证了两者的联合作用，结合人工质膜实验结果，对响应机制进行了初步的探索。实验筛选了不同的电活性物质或连接蛋白，通过含有8个精氨酸长链多肽（R8）的预先修饰，实现了功能物质在人工质膜表面的自组装，研究了修饰后体系对雌二醇的响应，为进一步研究不同修饰形式膜表面的结合奠定了基础。实验采用表面等离子体共振传感器（SPR）考察了修饰前后的动力学参数，利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定了偶联效果，原子力显微镜（AFM）验证了固定化效果，具体研究内容包括：.1.不同材料支撑双层类脂膜的构建：实验分别选择膜片电极和新鲜琼脂作为人工质膜的支撑材料，研究了膜的稳定性和不同成膜方法；成膜液成分以卵磷脂和胆固醇作为主要成分，根据不同的支撑材料，对浓度和配比进行了优化，构建了琼脂支撑的稳定双层类脂膜体系。.2.基于mER的自组装人工脂膜体系研究：利用构建的稳定双层类脂膜体系，构建了基于mER的自组装双层类脂膜，该体系对1×10-10mol/L 的17β-雌二醇可产生响应，浓度高于1×10-8 mol/L结合基本达到饱和。该体系对浓度为1×10-5 mol/L双酚A可产生响应，1×10-10mol/L17β-雌二醇和1×10-5mol/L双酚A同时作用时存在协同效应。重组人雌激素受体基因酵母菌双杂交体系研究结果表明：低浓度的雌二醇与双酚A混合作用的雌激素效应在低浓度呈现雌激素作用增强，在6.81×10-6mol/L后出现了抑制趋势。该模型的建立有助于进一步分析mER介导的环境雌激素作用机制，是现有环境雌激素评价方法的有益补充。.3. 基于精氨酸修饰的自组装人工脂膜体系研究：实验筛选了不同的电活性物质或连接蛋白，构建了R8饰的自组装人工脂膜体系。采用碳化二亚胺偶联方法研究了R8与抗17β-雌二醇抗体的偶联，MALDI-TOF-MS结果显示偶联比约为5:1,并合成了新型基质，对修饰位点进行了初步探索。SPR研究R8修饰偶联前后抗体亲和性能，AFM进一步测试了空白成膜液和自组装后成膜液的表面形态。实验采用竞争结合的方法验证了构建人工类质膜的响应，对雌二醇的响应范围分别为0.01-0