EphB1促进肝癌发生发展的机制及其活性调控

The expression of receptor tyrosine kinase EphB1 is dysregulated in clinical cancer tissues, suggesting that EphB1 may be involved in tumorigenesis. However, the exact roles and mechanisms involved have not been elucidated yet. In our preliminary study, we found that less diethyInitrosamine (DEN)-induced HCC was developed in EphB1 knockout mice. Based on this finding, we will examine the roles of EphB1 in HCC development at molecular, cellular, animal and clinical levels. Furthermore, we found that EphB1 activated ERK signaling pathway and interacted with ERK regulator Shp2, which will help us elucidate the molecular mechanisms involved in EphB1-mediated hepatocellular carcinogenesis. Meanwhile, our recent study revealed that EphB1 was SUMOylated by SUMO1 at lysine 785, which increased EphB1-mediated soft agar colony formation and activation of ERK signaling. We proposed to study the effect of EphB1 SUMOylation on HCC development and the mechanism involved. A successful outcome will advance our understanding of the mechanisms for HCC development and provide new target and insight into HCC treatment.

受体酪氨酸激酶EphB1在多种临床肿瘤组织中表达异常，提示其可能与肿瘤的发生发展相关，但具体作用及分子机制目前尚未阐明。前期我们利用EphB1基因敲除小鼠，通过化学诱导肝癌的方法，发现EphB1具有促进肝癌发生发展的作用。在此基础上，我们将从分子、细胞、裸鼠人肝癌原位移植、临床标本这四个层面系统地考察EphB1与肝癌的关系。前期我们还发现EphB1能激活ERK信号通路，并能与ERK上游调控因子Shp2发生相互作用，提示有可能存在EphB1-Shp2-ERK信号轴，这将为我们后续解析EphB1发挥功能的分子机制提供重要基础。同时，我们发现EphB1第785位赖氨酸上可发生类泛素化（SUMO）修饰，此修饰可正向调控EphB1的促细胞恶性生长功能及其下游的ERK信号。由此本项目的另一研究重点为深入研究该修饰对EphB1在肝癌中功能的影响及该修饰调控EphB1活性的分子机制。

受体酪氨酸激酶EphB1在多种临床肿瘤组织中表达异常，提示其可能与肿瘤的发生发展相关，但具体作用及分子机制目前尚未阐明。利用基因敲除小鼠，通过化学诱导肝癌的方法，我们发现EphB1具有促进肝癌发生发展的作用。相应地，过表达EphB1的肝癌细胞在软琼脂糖中的恶性生长能力明显增强，其体外迁移能力也显著增强。同时，我们发现外源EphB1蛋白可以发生SUMO化修饰，并且内源EphB1蛋白也存在SUMO化修饰。通过SUMOplot软件预测，EphB1有7个潜在的发生SUMO修饰的赖氨酸位点。我们将候选位点突变成无法发生SUMO修饰的精氨酸，用His-Ni-NTA pull down和免疫共沉淀方法确证785位赖氨酸为EphB1发生SUMO修饰的主要位点。EphB1的SUMO化修饰能够正向调控其促肝癌细胞恶性生长作用。为了深入研究EphB1在肿瘤发生发展中的重要性，我们也考察了EphB1在神经母细胞瘤中的作用，有趣的是，EhpB1在体内外都可以抑制神经母细胞瘤的生长。因此EphB1在不同类型的肿瘤中可能发挥着不同的作用。但与肝癌细胞一致的是，SUMO化修饰也能够正向调控EphB1的抑制神经母细胞瘤恶性生长的作用。. 进一步研究EphB1的SUMO化影响的细胞生长信号通路，我们发现EphB1过表达能明显下调PKCγ的磷酸化，而SUMO位点突变的EphB1却起着相反的作用。进一步，在SH-SY5Y-Vector和SH-SY5Y-K785R细胞中，敲低PKCγ的表达之后，克隆形成能力受到显著抑制，而SH-SY5Y-EphB1细胞的克隆形成能力却不受PKCγ表达水平的影响。因此，EphB1的SUMO化下调PKCγ的磷酸化，进而抑制肿瘤的生长。EphB1的K785 SUMO化位点附近有两个潜在的PKC磷酸化位点（S780和S781），当这两个丝氨酸突变成天冬氨酸以模拟磷酸化时，EphB1的SUMO化水平显著降低。如果将EphB1的S780和S781从丝氨酸突变成了丙氨酸以模拟去除磷酸化，与上述结果一致，S780A和S781A突变显著升高了EphB1的SUMO化水平。. 综上所述，本项目以EphB1为切入点，揭示了EphB1在肝癌和神经母细胞瘤发生发展中的重要作用，并阐明了EphB1发挥抗肿瘤作用的调控机制，不仅具有重要的理论意义，也将为开发肿瘤治疗的新靶标提供新方向。