应用于人类肠道菌群研究的高灵敏度蛋白质组学技术发展

Host–microbiome interactions, in particular in the context of intestinal immune systems, are increasingly considered as important factors influencing human health and diseases. Compared with the metagenomics analyzing the "static" gene sequences, metaproteomics can reveal the changes of proteins expressed in the host and microbiome, resulting in better understanding of the complex interactions between host and microbes. However, human gut microbiota contains thousands of species. The sensitivity of the existing proteomic analysis methods is still limited in some extent for the analysis of gut microbiota. This project aims to develop a combinational and high sensitivity proteomics technology for the study of gut microbiota. Large-scale proteome database of human gut microbiota is obtained by using simple and integrated spintip-based proteomics technology, which provides resource for their metaproteomics analysis. By developing integrated protein sample pretreatment technology based on strong cation exchange (SCX)-C18 biphasic monolith column and scheduled parallel reaction monitoring (sPRM) methods of mass spectrometry, we expect to establish a new strategy for the high sensitivity proteome profiling of limited cells from rare microbe. The combinational and high sensitivity proteomics technology will be applied to study the composition and dynamic change of the gut microbiota and the host–microbiome interactions, and provide a new strategy for the proteome profiling of single-cell microbe.

肠道免疫系统中宿主与微生物之间的相互作用对人体的健康和疾病状况有着重要的影响。与解析“静态”基因序列的宏基因组学相比，宏蛋白质组学能够揭示宿主和菌群蛋白表达的变化，从而更好地研究宿主与微生物之间复杂的相互作用。然而，肠道菌群涉及上千类菌种，现有蛋白质组学分析方法的灵敏度还不能满足其分析要求。本项目拟发展用于菌群研究的组合式、高灵敏度蛋白质组学技术：采用集成化技术获得人肠道菌群的大规模蛋白质组学数据库，为肠道菌群的宏蛋白质组学分析提供数据资源；通过发展基于强阳离子交换(SCX)和C18双相整体柱的集成化蛋白质样品前处理技术，减少样品损失，通过发展高分辨质谱的平行反应监测(sPRM)数据采集方法，提高灵敏度，建立针对少量菌种细胞的高灵敏度蛋白质组学分析新策略，应用于研究肠道菌群的组成、动态变化及其与宿主的相互作用；并为微生物单细胞蛋白质组学分析提供一种新的研究思路。

肠道免疫系统中宿主与微生物之间的相互作用对人体的健康和疾病状况有着重要的影响。与解析“静态”基因序列的宏基因组学相比，宏蛋白质组学能够揭示宿主和菌群蛋白表达的变化，从而更好地研究宿主与微生物之间复杂的相互作用。然而，肠道菌群涉及上千类菌种，样品非常复杂。本项目针对现有蛋白质组学分析方法灵敏度不足的瓶颈，系统地进行了方法学开发和应用研究。发展了针对少量菌种细胞蛋白质组学分析的高灵敏度RCPR技术，RCPR技术集成了基于强阳/强阴离子交换填料（SCX/SAX）的蛋白酶解和基于C18填料的多肽除盐，实现少量细胞样品的高灵敏度蛋白质组学分析。同时建立了高灵敏度、靶向性sPRM定量分析方法，实现少量细胞样品目标蛋白的精确定量分析。发展了针对少量菌种细胞分析的高灵敏度集成化蛋白质组学/磷酸化蛋白质组学样品前处理技术SISPROT、mixed mode-SISPROT、Phospho-SISPROT，实现少量细胞样品的大规模蛋白质组学分析和磷酸化蛋白质组学分析，为生物样本的蛋白质组分析提供了简单易行的样品前处理方案。最后，我们将上述发展的新方法应用于人类肠道菌群的宏蛋白质组学分析，包括（I）建立人类肠道菌群的大规模蛋白质组数据库(包含27128个蛋白质和151671条多肽)，（II）人类肠道菌群的菌种分类鉴定，（III）宿主和肠道菌群的相互作用分析；为肠道菌群的宏蛋白质组学分析提供了数据资源，为研究肠道菌群的组成、动态变化及其与宿主的相互作用提供了一个系统工具，对以菌群为靶点的药物开发以及精准医疗具有重大的意义。