AP2转录因子负调控原花色素生物合成的分子机理研究

Proanthocyanidins play important roles in plant growth and development, and biotic stresses and abiotic stresses. Proanthocyanidins also have beneficial effects for human health. It was suggested that unknown genes possibly play key roles in repressing TT2 or MBW complexes containing TT2, and further negatively regulate the proanthocyanidins biosynthesis. But it is still unknown which genes are involved, and what the molecular mechanism is underlying this regulation. By taking transcriptomic and reverse genetic approaches, we found that the color of seed coat in ap2 mutants was darker than the wild type due to the higher level of proanthocyanidins. Except for the micropyle and the chalaza, seed coat in AP2m3 overexpressing lines, which do not introduce an amino acid substitution and disrupt the miRNA172 binding site, exhibited transparent testa phenotype due to a dramatic decrease of proanthocyanidins accumulation. AP2 did not affect the accumulation of flavonols and anthocyanins. These results suggest that AP2 specifically represses proanthocyanidins biosynthesis in the seed coat except for micropyle and chalaza. This proposal will mainly focus on elucidating the molecular mechanism of AP2 regulating proanthocyanidins biosynthesis, by using molecular biology, genetics and metabolite analysis approaches. This study will further improve our knowledge in the regulation of proanthocyanidins biosynthesis, and further improve plant proanthocyanidins biosynthesis.

原花色素在植物的生长发育和逆境胁迫中起着重要的调控作用，对人类健康有诸多益处。诸多研究暗示存在未知的关键基因负调控TT2或与之相关的MBW三元复合物的功能，进而负调控原花色素的积累，但什么基因参与其中，及其调控的分子机理仍然不清楚。本研究利用转录组学和反向遗传学的方法，发现ap2突变体种皮颜色比野生型更深，积累更多的原花色素；AP2m3（编码的蛋白与AP2的相同，但其mRNA不能够被miRNA172结合）过量表达的种皮除珠孔和合点之外显著变浅，原花色素含量大幅下降；突变体和过量表达均不影响黄酮醇和花青素的积累。这些结果表明，AP2在珠孔和合点之外的种皮中特异地负调控原花色素的生物合成。本项目将利用分子生物学、遗传学和代谢物定量分析的手段，确定AP2调控原花色素生物合成途径中的靶基因和关键转录因子，阐明AP2调控原花色素生物合成的遗传网络，为改良植物原花色素生物合成和代谢提供重要的理论支撑。

原花色素在植物的生长发育和逆境胁迫中起着重要的调控作用，对人类健康有诸多益处。许多研究暗示存在未知的关键转录基因负调控TT2或与之相关的MBW三元复合物的功能，进而负调控原花色素的积累，但什么基因参与其中，及其调控的分子机理仍然不清楚。我们发现AP2调控原花色素的积累，不调控黄酮醇和花青素的积累，特异地抑制原花色素的生物合成，但AP2的同源基因及miRNA172不调控原花色素的生物合成。通过基因表达分析发现原花色素生物合成途径中后期基因ANR、TT12、TT19和AHA10以及关键转录调控基因TT2的表达水平受到AP2的负调控，而起抑制原花色素生物合成的MYBL2的基因表达水平显著地被AP2正调控。进一步通过转录活性分析和染色质免疫沉淀分析发现MYBL2是AP2调控原花色素生物合成的靶基因，同时通过酵母双杂交、BIFC和免疫共沉淀分析发现AP2-MYBL2-TT8或AP2-MYBL2-EGL3形成蛋白复合物。进一步的转录活性分析揭示了AP2通过MYBL2抑制MBW三元复合物对其下游靶基因的转录激活。遗传分析揭示了AP2遗传上作用于MYBL2和MBW三元复合物的上游，通过MYBL2调控原花色素的生物合成。.根据上述所有的研究结果，AP2调控原花色素生物合成的分子机制包括两个方面：一方面，AP2可以在转录水平上，通过直接结合MYBL2的启动子区，进而激活MYBL2基因的表达；另一方面，AP2可以在蛋白水平上直接与MYBL2相互作用，通过MYBL2蛋白与TT8或EGL3蛋白相互作用，形成AP2-MYBL2-TT8或AP2-MYBL2-EGL3蛋白复合物，破坏了MBW三元复合物的形成，最终抑制了原花色素生物合成途径中后期基因（LBGs）如ANR、TT12、TT19和AHA10等基因的表达，抑制了原花色素的生物合成。.综上所述，AP2特异地抑制原花色素的生物合成；确定了MYBL2是AP2调控原花色素生物合成的靶基因；确定了AP2-MYBL2-TT8或AP2-MYLB2-EGL3形成蛋白复合物；阐明了AP2负调控原花色素生物合成的遗传网络，有助于全面系统地解析原花色素生物合成的调控网络。通过解析AP2调控原花色素生物合成的基因网络和遗传网络，为进一步改良植物原花色素生物合成和代谢提供重要的技术和理论支撑，为品种改良提供参考。