非天然甲醇同化新途径的构建与适配机制研究

In order to realize the effective utilization of one-carbon compound resources, it has become a hot topic in recent years that to design and construct a new one-carbon metabolic pathway by synthetic biological methods. However, the adaptation of artificial metabolic pathway to natural host is one of the main obstacles for the construction of new metabolic pathway. In view of the problems of long methanol metabolism pathway and low utilization rate of carbon conversion, this study designed a new and efficient methanol metabolic pathway composed of methanol dehydrogenase Mdh and aldolase BFD to convert methanol into DHA (1,3-dihydroxyacetone). DHA enters the central metabolic pathway after intracellular phosphorylation. In order to reveal the construction and adaptation mechanism of artificial metabolic pathway, the adaptation of new metabolic pathway with host strain will be studied from three aspects: enzyme modification, efficient and coordinated expression of enzymes and optimization of metabolic regulation in vivo by using computer-aided design and high-throughput screening, isotope tracer and transcriptome analysis techniques. It not only lays the foundation for the efficient methanol bioconversion, but also can be used as reference for the construction and adaptation of other non-natural metabolic pathways.

为了实现一碳资源的有效利用，通过合成生物学方法人工设计及构建新的一碳代谢途径成为近年来的研究热点。而人工设计代谢途径与天然宿主的适配成为制约新代谢途径构建的主要障碍之一。本项目针对现有一碳化合物甲醇代谢途径长，碳转化利用率低的问题，构建了一条由甲醇脱氢酶Mdh和醛缩酶BFD组成的短而高效的甲醇同化新途径，完成甲醇到DHA（1,3-二羟基丙酮）的转化，DHA在胞内磷酸化后进入中心代谢途径。进一步利用计算辅助设计和高通量筛选、同位素示踪和转录组分析等技术，从酶的改造、酶的高效协调表达和体内代谢调控优化三个方面研究新代谢途径与宿主菌的适配，揭示人工设计代谢途径的构建和适配机制，不仅为甲醇等一碳资源的高效生物转化利用奠定基础，同时对其它非天然代谢途径的构建及适配具有重要的借鉴意义。

为实现一碳资源的有效利用，本项目尝试构建了一条由甲醇脱氢酶MDH和醛缩酶BFD组成的甲醇同化新途径，完成甲醇到1,3-二羟基丙酮（DHA）的转化，后在胞内磷酸化后进入中心代谢途径。一个新途径的体内构建，涉及新途径参与酶的改造，体外新途径的实现，底盘的选择和优化，以及体内新途径的实现和适配。而酶的改造直接决定了参与酶所在代谢途径是否能够在体内实现，同时与底盘的选择和优化共同决定了新途径在体内的进一步适配。.本项目完成了MDH的改造及胞内适配，而BFD由于其可生成DHA和羟基乙醛两种产物，因此对其进行了两种产物方向的酶改造，并针对有毒产物羟基乙醛又设计了一条经乙酰磷酸合成酶ACPS和PTA作用生成乙酰辅酶A的新途径，并实现了体外途径的构建。但两种策略的BFD多轮酶改造后，其对甲醛的亲和力提高遭遇瓶颈，限制了新途径在胞内的实现，而这源于底物甲醛分子过小。当底物分子量低于350 Da时，酶对底物的Km值与底物分子量呈现线性相关性。推测BFD对甲醛的极限Km约在10mM-100mM。所以酶参与的对甲醛分子的催化速率普遍不高，而甲醛与甲醛的缩合，需要两分子或三分子甲醛同时被酶催化，理论上其反应速率会呈现指数级下降。因此，新途径的构建，不仅要考虑催化酶的选择和改造，同时也要对反应底物进行考察。优先选择位于中心代谢途径中的催化酶；不同类酶的动力学参数可能拥有数量级的差异，酶的类别选择也同样重要。.此外，为了更好的适配新的代谢途径，我们通过毕赤酵母甲醇异化途径阻断和驯化的方式进行优化，实现底盘甲醇转化和耐受性大幅提高，并通过组学分析解析了全细胞基因表达调控，在甲醇耐受和转化方面有了新的发现，如醇脱氢酶ADH7和醛脱氢酶ALD4-2可能参与甲醇的异化。不仅为天然和合成甲醇利用菌株甲醇转化和耐受性提高提供更多的研究靶点和思路，同时也更加充实了毕赤酵母代谢机理方面的研究。