球孢白僵菌MAPKK-Ste7激酶调控多磷酸化信号的传导机制

Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) signaling pathways are ubiquitous and evolutionarily conserved networks in fungal pathogens, and that function as a modulator to survive in various environments and invade hosts. Ste7 acts as an intermediate kinase in the Fus3/Kss1 pathway of Beauveria bassiana to regulate vegetable growth, asexual development and host infection. Intriguingly, B. bassiana phosphoproteome showed Ste7 kinase harbors more serine/threonine phosphorylation sites than Saccharomyces cerevisiae in C-terminal, indicating that Ste7 triggers signal transduction is specific and novel in B. bassiana, even in fungal pathogens. However, the Ste7 C-terminal and phosphorylation sites are functionally unexplored in either B. bassiana or other filamentous fungi. Herein, we propose the project on the basis of our previous findings to seek out the feature and function of the specific Ste7 C-terminal in signal transduction. By analyses of the multi-phenotypes, Ste7-mediated proteome and phosphoproteome, phosphorylation levels and Ste7 structure, our goals aim at: (1) assigning biological processes to the C-terminal phosphorylated amino acids; (2) unveiling a novel phosphorylated-signaling hub for Ste7 possible crosstalk between the Ste7 and interplay with other signaling pathways; and (3) making use of the revealed Ste7-mediated signaling networks to identify various asexual cycle and anti-stress effector genes in B. bassiana.

Ste7激酶是真菌介导生长发育Fus3/Kss1信号通路的居中激酶，在有性发育、丝状生长和毒力调控等生物学过程中十分关键。我们前期研究发现，球孢白僵菌Ste7激酶只比酿酒酵母多出一段含多磷酸化修饰的C末端，其多磷酸化位点失活会导致球孢白僵菌的孢子形成、碳氮源利用和昆虫体表侵染等过程严重受阻。据此，本项目拟展开以下研究：①Ste7-C端磷酸化修饰对Fus3/Kss1信号通路中磷酸化传导的影响；②Ste7激酶与其他信号通路的交叉对话的分析。通过以上研究，本项目将明确球孢白僵菌Ste7激酶C端磷酸化修饰与Fus3/Kss1信号通路和其他信号通路之间的对话机制，形成以Ste7激酶为枢纽的球孢白僵菌蛋白/磷酸化信号网络，深入发掘下游无性发育、抗逆和毒力相关的效应因子，并为深入研究生防菌剂改良和植物抗病抗逆育种提供科学依据。

本资助项目执行期间，基于基因敲除、磷酸化位点突变、TMT定量质谱等实验方法，重点开展Ste7-C 端磷酸化修饰对Fus3/Kss1激酶三联体的生物功功能和磷酸化信号传导的，以及Ste7 激酶及其Ser362与其他信号通路的交叉对话等研究内容。研究发现：（1）Fus3/Kss1激酶三联体缺一不可，它们共同调控球孢白僵菌的无性发育、营养利用、环境响应、侵染毒力等；（2）中激酶Ste7的Ser362是三联体形式正常生物学功能的关键，复杂接受上激酶Ste11磷酸化信号，传递信号并激活中激酶Ste7的双磷酸活化环Ser216/Thr220，进而激活下激酶Mpk1的双磷酸化活化环Thr186/Tyr188，从而调控球孢白僵菌的孢子生成、丝状生长和侵染昆虫等生物学过程；（3）中激酶Ste7主要通过Ser362调控大量蛋白和磷酸化修饰参与球孢白僵菌的生命过程，分别占据所定量蛋白和磷酸化修饰的34%和33%，这些显著变化的蛋白质参与细胞能量代谢、遗传信息处理、细胞分裂、环境应激等生物过程；（4）中激酶Ste7和Ser362一方面通过直接调控关键蛋白激酶的表达和磷酸化修饰，另一方面通过交叉调控其他信号通路的关键组件，对球孢白僵菌的细胞分裂、菌丝生长、环境胁迫等做出相应的应答机制。该项目的研究结果表明，球孢白僵菌MAPKK-Ste7调控蛋白表达和磷酸化修饰的主要归因于Ste7-Ser362能够正常发挥功能，这对Ste7和Mpk1的双磷酸催化环的活化非常关键。本项目研究深刻揭示了球孢白僵菌Fus3/Kss1激酶三联体调控和转导磷酸化信号的关键磷酸化位点，系统构建了基于中激酶Ste7和Ser362为枢纽的蛋白质表和磷酸化修饰谱，其研究结果将加深对MAPK信号通路的认识，也有助于拓展中激酶Ste7的单磷酸化位点Ser362在虫生真菌的生长发育、侵染毒力、环境应答等过程的认识。