家蚕中影响RNA干扰效率的因子与dsRNA相互作用的研究

RNAi is a mechanism of post-transcriptional regulation of gene expression, where the pathways are extensively studied in the dipteran model insect Drosophila melanogaster and the response is robust in the coleopteran model insect Tribolium castaneum. However, in Lepidoptera including the model insect Bombyx mori, the RNAi pathways are still not clear and a smaller rate of efficiency was reported. This refractoriness is due to the uptake and delivery of dsRNA, the expression levels of RNAi machinery components, presence of RNA degrading enzymes to clear dsRNA, and the immune response instead of RNAi response triggered by dsRNA. Recently, we have found that R2D2 was strictly and slightly expressed in silkmoth, dsRNase can digest dsRNA in cell culture, and dsRNA can inhibit the transcription of Toll9-1 and trigged the transcription of Dicer-2 in Toll9-1 persistent expression cell line. To gain insight into the factors that might determine the efficiency of RNAi, several factors, including R2D2, dsRNase and Toll9, will continue to be investigated. Their interactions with dsRNA and RNAi will be studied in the silkmoth B. mori and Bm5 cells.

RNA干扰是一种转录后基因沉默的机制，它在双翅目的果蝇中的通路非常清楚，在鞘翅目的赤拟谷盗的效果非常明显；然而，在家蚕等鳞翅目昆虫中，RNA干扰的通路尚不明确，其成功率也非常低；这与其对dsRNA的吸收和传递、RNA干扰通路上核心基因的表达水平、昆虫体内的RNA降解酶、dsRNA引起免疫反应取代了RNA干扰反应等有关。近年来，我们对R2D2、dsRNA降解酶、Toll9等几个与dsRNA相互作用的因子进行了初步的研究；我们发现R2D2仅在少量的组织微量表达；dsRNA降解酶能在昆虫细胞表达并降解dsRNA；dsRNA能够抑制Toll9-1的转录水平，并上调持续表达Toll9-1的家蚕细胞中Dicer-2的转录水平；本项目将继续以R2D2、dsRNA降解酶、及Toll9为研究对象，以家蚕幼虫和家蚕Bm5细胞为材料，深入研究它们与dsRNA的相互作用、以及哪个因子可能影响家蚕的RNA干扰效率。

RNA干扰是一种转录后基因沉默的机制，在双翅目的果蝇中研究得比较清楚，在鞘翅目的赤拟谷盗中效果非常明显，但在家蚕等鳞翅目昆虫中RNA干扰相关的机制尚不明确、干扰效率也不高。本项目对影响RNA干扰效率的因子，包括R2D2、dsRNase和Toll9受体为研究对象，以家蚕幼虫和家蚕细胞株为材料，研究了它们与dsRNA相互作用的关系。克隆获得全长BmR2D2片段，并在家蚕细胞株转染与表达，发现在共表达BmDcr2的情况下，BmR2D2可以提高细胞株中RNA干扰效率；同时dsRNA可以上调BmR2D2在家蚕幼虫中的转录水平。根据BmdsRNase的蛋白结构，克隆三个不同的BmdsRNase片段并构建了三个不同的表达载体；通过原核表达，诱导特异蛋白条段的表达；对诱导的蛋白进行纯化，可消化dsRNA；同时可以降解导入家蚕幼虫体内的dsRNA，影响RNA干扰效率。对BmToll9受体的BmToll9-1和BmToll9-2分别进行研究，发现BmToll9-1可以和dsRNA结合；dsRNA可以诱导BmToll9-2的上调表达；在共表达BmToll9-2的家蚕细胞株中，可以提高RNA干扰效率。通过以上的研究，进一步了解这几个因子与dsRNA相互作用的关系，对RNA干扰效率的影响，以及在RNA干扰机制中的作用，为阐明家蚕等鳞翅目昆虫的RNA干扰通路奠定理论和实验基础。