甾类激素合成途径中生物大分子功能簇的结构与功能研究

Steroid hormone is a class of lipophilic molecules regulating important physiological process, such as development, immunity and sexual determination, and their biosynthesis and metabolism are catalyzed by a macromolecular cluster consisted of various reductases, dehydrogenases, lyases and aromatases. The activity balance among the enzymes in this cluster contributes to the physiological levels of steroid hormones, making the structural basis for their functions not only a key to understanding the signal transductions mediated by.steroid hormones, but also a guide to design and optimization of medicines targeting on steroid hormone biosynthesis pathway. Recognizing and binding to the lipophilic molecules as substrates and products, enzymes involving in steroid hormone biosynthesis comprise many hydrophobic membrane proteins which cause difficulties in crystallization and structure determination. In order to solve the problems in studies on membrane protein structures such as tiny crystal size, low diffraction and large sample amount in screening, routine beamlines should be upgraded to generate x-ray beam with smaller size and higher intensity, as well as more powerful automatic data collecting and processing. The enhanced beamlines will be validated for their functions during the proposed structural studies on steroid hormone biosynthesis pathway and optimized accordingly, thereby meeting the novel challenge in membrane protein crystallography.

甾类激素是一大类在生物的发育、免疫、性别决定等重要生理过程中发挥调控作用的亲脂性分子，它们的生物合成与代谢过程是由多种还原酶、脱氢酶、裂解酶和芳香化酶所组成的大分子功能簇来实现的。该簇中酶之间活性的平衡决定了各种甾类分子在体内的水平，阐明这些生物大分子行使功能的结构基础不仅是了解甾类激素调控的细胞信号转导过程的关键，而且可以为以甾类激素生物合成通路为靶点的医疗方案提供药物设计与优化的指导。作为以亲脂性分子为底物和产物的功能大分子，参与甾类生物合成的酶包括大量疏水性膜蛋白，其结晶与结构解析存在较大的复杂性。为解决膜蛋白结构研究中存在的晶体微小、衍射能力低下以及需要海量晶体筛选的困难，光束线站必须经升级改造以具备更小光束直径、更高光束亮度和更强大的自动化数据采集和处理能力。所构建的强化线站可在针对甾类激素合成大分子功能簇的晶体学研究中进行实际验证和调整，从而能够满足膜蛋白晶体学所带来的挑战。

本项目主要利用上海光源大科学装置，针对甾类合成以及调控相关的蛋白质进行晶体学研究，特别是难于结晶的膜蛋白。同时针对晶体学研究中出现的问题，优化光源线站的硬件参数，使其更适用于在难衍射低质量的晶体上进行X射线数据采集。本项目主要研究内容包括，甾类合成酶类及调控蛋白的表达筛选以及纯化条件探索，最终进行膜蛋白结晶以及结构分析工作。经过三年的实施，本项目已经完成超过四种重要人源膜蛋白的纯化与结晶尝试，获得两种重要膜蛋白的晶体，并利用上海光源BL18U以及BL19U的线站进行了数据采集并完成结构解析工作。本项目共完成四个膜蛋白晶体结构的数据库发表工作，同时发表科研论文两篇，学术专著一部。本项目主要解析了Spinster蛋白在裙带菌丝单胞菌（拉丁名：Hyphomonas neptunium）的类似蛋白HnSPNS的晶体结构，使人们首次得以在分子水平观察Spinster家族蛋白的整体折叠和底物结合部位。HnSPNS的结构存在着典型的MFS转运蛋白折叠模式，主要由12个跨膜输水螺旋组成，并且N末端的6个跨膜螺旋与C末端的6个跨膜螺旋对比呈高度相似的伪对称重复结构域。在动物体内进行功能实验中所发现的一些关键的残基，例如E217（果蝇）和R153（斑马鱼），均定位于HnSPNS的底物结合部位，同时在该区域还鉴定出一个不属于蛋白质主链的未知电子密度，据推测可能来自于表达与纯化过程所结合的转运底物。本发现为进一步解析人类Spinster家族蛋白的结构提供了可靠的三维模型，同时也为研究其在维持溶酶体及衍生细胞器的功能与形态提供了新的启示。