GRP78介导非经典自噬在肝癌索拉非尼耐药中的作用机制研究

Acquired resistance to sorafenib is a common phenomenon in the advanced HCC patients who undergone sorafenib-based therapies and greatly restrains its application . However, the underlying mechanism by which tumor cells developed the resistance to sorafenib remains unclear. Our previous studies found that autophagy is associated with the development of acquired resistance to sorafenib and the levels of GRP78 is positively correlated with that of ATG5.Therefore, it was hepothesized that autophagy induced by GRP78 plays important roles in the development of acquired resistance to sorafenib. This study will lay a theoretical foundation for the treatment of acquired resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma, and has both clinical and social significance.

对索拉非尼的获得性耐药是晚期肝癌患者接受索拉非尼治疗后的一种常见现象，极大地限制了其应用。然而，肿瘤细胞对索拉非尼产生耐药性的潜在机制尚不清楚。我们前期研究发现，自噬与索拉非尼获得性耐药的发生有关，GRP78表达水平与ATG5呈正相关，推测GRP78诱导的自噬在索拉非尼获得性耐药过程中起重要作用。本项目拟揭示，GRP78诱导自噬的潜在机制及GRP78调控ATG5的分子机制，进而阐明GRP78以ATG5依赖方式诱导的非经典自噬在肝癌索拉非尼耐药中的重要作用。本研究将为肝细胞癌索拉非尼获得性耐药的治疗奠定理论基础，兼具临床和社会意义。

肝细胞癌具有高抗药性且治疗困难的特点，获得性耐药是接受索拉非尼治疗的肝细胞癌患者的常见现象。已有研究表明，GRP78可以诱导自噬，其过度表达会使肿瘤细胞产生耐药性，然而，GRP78是如何诱导自噬及其在索拉非尼诱导自噬中的作用机制尚不清楚。在本项目中，我们首先通过异种移植小鼠模型发现自噬与索拉非尼获得性耐药的发展有关。进一步研究发现，在索拉非尼耐药细胞中，GRP78表达水平与自噬和ATG5相关。为了探讨GRP78诱导自噬的相关分子机理及其在索拉非尼诱导自噬中的作用，我们构建了携带Flag标签的野生型GRP78真核表达载体，转染肝细胞癌细胞后发现GRP78能够诱导自噬并上调ATG5表达。利用shRNA敲低ATG5和BECN1，我们发现敲低ATG5而不是BECN1抑制了GRP78对自噬的诱导作用。为了揭示ATPase和PBD结构域在诱导自噬中的功能性作用，利用Flag标记的野生型GRP78及删除ATPase、PBD结构域的突变体转染EGFP-LC3肝细胞癌细胞，结果显示GRP78诱导的自噬依赖于ATPase结构域。通过免疫共沉淀及体内泛素化实验证实GRP78与ATG5相互作用，并通过抑制ATG5蛋白的泛素化而稳定其表达。为了明确ATG5介导的自噬与索拉非尼耐药的关系，在shGRP78-HepG2-SR细胞中过表达ATG5，结果表明抑制GRP78诱导的自噬，影响了肝细胞癌细胞对索拉非尼的耐药性。此外，我们建立了GRP78肝脏特异性基因敲除小鼠模型，免疫组化结果显示，GRP78诱导的自噬依赖于ATG5，而不依赖于BECN1，这是一种非经典自噬。本项目的研究结果将为肝细胞癌索拉非尼获得性耐药的治疗奠定理论基础，靶向GRP78可能是一种很有前景的治疗策略，从而改善晚期肝癌的治疗现状。