白细胞介素-4调控巨噬细胞分化在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

Inflammation and macrophages play pivotal role in cerebral ischemic injury. Macrophages can exert pro-inflammatory or anti-inflammatory effects after stroke depending on the functional phenotypes, M1 or M2 macrophages, to which they are polarized. After stroke, both microglia and monocytes transform into macrophages, but their polarization and function remain unclear. IL-4 plays a central role in the differentiation of Th2 cells that produce anti-inflammatory cytokines and in suppressing generation of Th1 cells, which produce pro-inflammatory cytokines. M1 and M2 macrophages are inducers and effectors in Th1 and Th2 immunity. We previously found IL-4 KO resulted in greater Th1 and microglia/macrophage infiltration, and increased Th1/Th2 ratio in Balbc/J mice, but the effects of IL-4 on macrophages polarization, function and the related mechanisms post stroke still have not been clarified. In the present study, by using macrophage-specific M2 (IL-4 receptor) gene knockout mice and flow cytometry, bone marrow transplantation and BioMarker system, we try to identify the distinctive role of monocytes derived macrophages (MoDMs) and microglia derived macrophages (MiDMs) in cerebral ischemic injury, and study which macrophage polarization, MiDM or MoDM, determines stroke outcome, we also try to investigate the effects of M2 activator, IL-4 on transient focal cerebral ischemic injury. Our results would provide new methods and potential treatment for the basic research and ischemic cerebrovascular diseases.

脑缺血再灌注性损伤（CIRI）缺血损伤区巨噬细胞(mФs）来源于小胶质细胞（MiDM）和外周单核细胞(MoDM)，两者在不同细胞因子微环境下可分化为经典激活mФs（M1）或替代激活mФs（M2)，并分别具有促炎或抗炎效应，但它们在CIRI中的独特功能及分化机制未清。白细胞介素-4（IL-4）是辅助T细胞Ⅱ型（Th2)抗炎细胞因子，在M2转化中起关键作用；我们前期研究显示， 缺血区MiDM与MoDM的48种功能基因呈差异性表达；IL-4缺陷小鼠CIRI加重并伴有缺血区Th1/Th2比例增加及mФs增多，但IL-4如何影响mФs的分化、功能及信号机制，尚未阐明。本项目拟进一步采用巨噬细胞条件性IL-4受体敲除小鼠，应用流式分选、骨髓移植等技术，观察脑卒中MiDM与MoDM的分化、表型功能及信号改变，从而阐明它们在CIRI中的的独特功能及IL-4在其中的作用及调控机制，为脑卒中的防治提供新思路。

背景与目的：脑缺血再灌注性损伤（CIRI）缺血区巨噬细胞(mФs）来源于小胶质细胞（MiDM）和外周单核细胞(MoDM)，两者可分化为经典激活mФs（M1）或替代激活 mФs（M2)，并分别具有促炎或抗炎效应，但它们在CIRI中的独特功能及分化机制未清。白细胞介素-4（IL-4）在M2转化中起关键作用，但IL-4如何影响mФs的分化、功能及信号机制尚不清楚。本项目拟采用巨噬细胞条件性IL-4受体敲除小鼠，应用流式分选、骨髓移植等技术观察脑卒中MiDM与MoDM的分化、表型功能及信号改变，从而阐明它们在CIRI中的的独特功能及IL-4在其中的作用及调控机制，为脑卒中的防治提供新思路。.材料与方法：通过采用 WT 和 IL-4Rα KO 小鼠构建在体 MCAO 模型，观察脑缺血再灌注后不同时间点巨噬细胞条件性 IL-4Rα 基因敲除对脑缺血再灌注脑损伤的影响，应用流式细胞分选技术、免疫荧光染色和 BioMark 多基因检测系统，检测炎症细胞的动态分布及功能情况，并观察与M1、M2分化相关的信号途径分子表达变化；采用小鼠骨髓移植技术对WT或 IL-4Rα KO小鼠进行骨髓相互移植后构建MCAO模型，验证外周单核巨噬细胞或小胶质细胞上的 IL-4 受体信号在脑卒中中的关键作用及机制；提取WT小鼠骨髓单核细胞，分别在 LPS 或 IL-4 刺激下诱导极化成 M1 或 M2，并与原代神经元共培养，在OGD/RX后观察不同极化状态的巨噬细胞对神经元缺糖缺氧损伤的直接效应；通过静脉注射外源性 IL-4 复合体以及构建 IL-4 高表达慢病毒质粒，进一步探讨IL-4 对脑缺血再灌注损伤的作用及对巨噬细胞的浸润、功能变化的影响及机制研究。.结果：与WT小鼠相比，巨噬细胞条件性 IL-4Rα 基因敲除在MCAO模型后脑梗塞体积、神经功能缺损加重，小胶质细胞激活和外周单核细胞浸润至缺血区增多，但小胶质/巨噬细胞以M1型为主，并且Akt/mTOR信号通路相关分子发生变化，而通过不同途径外源性补充IL-4后WT组和转基因组结果并无明显差异，并提示IL-4具有神经保护作用，可能是通过影响小胶质/巨噬细胞极化的方式发挥效用，随后的骨髓移植实验和体外实验也得到同样的趋势，进一步证实了这一猜想。.结论：IL-4通过Akt/mTOR信号通路参与调控小胶质/巨噬细胞极化，进而发挥在缺血性脑卒中的保护作用。