基于知柏地黄丸配伍环境的关黄柏治疗肾阴虚相火亢盛的药效物质基础研究

历史上关黄柏为黄柏的道地药材，味苦性寒，清热泻火坚阴，独有之功是退虚热，治疗阴虚相火亢盛，可平衡"相火与肾水"，知柏地黄丸为代表方剂。临床上阴虚发热、骨蒸劳热、梦遗滑精诸虚劳证，必用黄柏退其热而达阴阳之平衡，其独特疗效是其它苦寒药不能替代的。然而，对关黄柏药效物质基础的认识薄弱，除小檗碱、黄柏酮外，关黄柏治疗肾虚发热，相火亢盛的药效物质基础并不清楚，导致关黄柏经典的泻火坚阴治疗价值的利用利用大打折扣，也制约了关黄柏内在质量控制方法的提升。本项目基于"中药的有效成分不是孤立的，不同配伍环境，同一中药将表达不同的体内成分，只有在一定的配伍环境下，中药才有相对稳定的药效物质基础"的假说，基于UPLC-MS-MS技术，利用中药血清药物化学方法，基于知柏地黄丸的配伍环境，通过口服药物后血清中的成分分析，鉴定黄柏治疗肾虚发热，阴虚相火亢盛的药效物质基础，为质量评价及创新药物设计提供依。

关黄柏为传统中药，独有之功为退虚热，本项目选择了治疗阴虚相火亢盛的经典方剂知柏地黄丸作为研究对象，明确关黄柏在知柏地黄丸配伍环境下的药效物质基础，为关黄柏的质量评价及创新药物开发提供依据。通过关黄柏在知柏地黄丸配伍后的体内移行成分及选择性吸收成分质和量的变化分析，揭示了中药配伍的意义，并首次阐明了关黄柏在知柏地黄丸配伍下治疗阴虚相火亢盛的体内直接作用物质为关黄柏生物碱类、柠檬苦素类及酚酸类成分；采用辣椒素注入大鼠前列腺方法复制慢性非细菌性前列腺炎动物模型，以行为学、病理生理学及代谢组学的数据为指标，评价了关黄柏体内直接作用物质小檗碱及黄柏内酯对慢性非细菌性前列腺炎的干预作用，研究发现，小檗碱及黄柏内酯均能对各指标及前列腺炎相关的潜在生物标记物产生明显的回调作用（p<0.05），明显抑制前列腺炎的发生或发展。在代谢组学研究中，进一步明确了苯丙氨酸代谢通路中的马尿酸及甘氨酸为重要的、与炎症相关的潜在生物标记物；采用人前列腺癌22RV1细胞注入裸鼠前肢腋下方法复制前列腺癌动物模型，以病理生理学及代谢组学的数据为指标，评价了关黄柏提取物、生物碱类成分、柠檬苦素类成分、小檗碱和黄柏内酯对前列腺癌的治疗作用。研究发现，关黄柏提取物、生物碱类成分、柠檬苦素类成分、小檗碱及黄柏内酯均能对各指标及前列腺癌相关的潜在生物标记物产生明显的回调作用（p<0.05），明显抑制前列腺癌肿瘤的发展及转移。首次研究了关黄柏治疗前列腺癌的主要有效成分，诠释了生物碱类和柠檬苦素类在关黄柏治疗前列腺癌过程中的协同作用，在代谢组学研究中，进一步明确了13个与前列腺癌密切相关的代谢通路及34个潜在生物标志物。 本课题进一步对关黄柏活性成分小檗碱、黄柏内酯、黄柏酮及木兰碱进行了基于细胞代谢组学的关黄柏组分抗前列腺癌功效研究。以形态学、MTT比色法以及流式细胞术分析前列腺癌细胞系22rv1在给药前后的细胞形态变化、细胞存活和增殖状况以及药物诱导凋亡的作用和作用强度，从药效学角度评价关黄柏四个组分体外抗前列腺癌活性。同时进行代谢轨迹和代谢足迹的细胞代谢组学研究，分别对四个单体成分作用于前列腺癌细胞系22RV1后，分析细胞代谢的轨迹和足迹变化，确定药效的生物标志物进行代谢经路研究，阐明关黄柏组分治疗前列腺癌的整体效应机制。本部分实验得到了与动物实验类似的结果，为发现临床有效且毒副作用小的抗前列腺癌药物提供一定依据。