松褐天牛肠道细菌Pantoea agglomerans MG2在拮抗球孢白僵菌侵染中的作用研究

The Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, plays an important role in dissemination of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Beauveria bassiana is able to penetrate the host integument and is used as a biocontrol agent to control M. alternatus. However, low killing speed and sensitivity to adverse environment factors limit the widespread use of the B. bassiana. In our prophase research, a B. bassiana strain CZB-02 had been isolated from the dead adult M. alternatus. The strain CZB-02 can infect the M. alternatus through oral feeding. The study also found that the gut bacterium Pantoea agglomerans MG2 can influence the infection process of B. bassiana, but what role does the gut microbiota play in the infection remains unclear. In this propose, the bacterial suspensions of P. agglomerans MG2 were prepared and fed to the larvae of M. alternatus. Then, the effect of live bacteria on colonisation resistance was assessed by light and electron microscopic observations as well as qPCR, and the antifungal compounds from P. agglomerans MG2 were also identified. In some extent, those study will not only expound the immune mechanisms of gut microbiota-host interactions defense against fungal infections, but also would facilitate engineering and improving the virulence of mycoinsecticides through genetic modification.

松褐天牛是松材线虫病的最主要传播媒介。白僵菌可通过体壁侵染方式感染松褐天牛，但防治效果不稳定，致死时间长，限制了其推广应用。申请人前期分离到一株可经消化道侵染松褐天牛的球孢白僵菌，同时发现松褐天牛肠道细菌可以影响该菌株侵染效果，并从肠道内分离到一株球孢白僵菌拮抗细菌--成团泛菌Pantoea agglomerans MG2，表明肠道细菌在昆虫防御病原菌侵染中发挥着重要作用，但具体作用机制尚不明确。为明确肠道细菌在抵御球孢白僵菌侵染中作用，本研究拟将P. agglomerans MG2重新接种到松褐天牛体内，采用电镜观察结合实时荧光定量PCR，原位研究P. agglomerans MG2对球孢白僵菌侵染松褐天牛的影响，并纯化鉴定其产生的主要抑菌物质。本项目的开展将有助于阐明肠道细菌在协助宿主抵御病原菌侵染中的作用，同时也为开发具有体壁和消化道双侵染途径的球孢白僵菌新制剂奠定理论基础。

肠道细菌在昆虫防御病原菌侵染中发挥着重要作用，但具体作用机制尚不明确。本项目研究了白僵菌侵染不同阶段，肠道微生物多样性和群落组成的差异。同时，研究了Pantoea agglomerans MG2对球孢白僵菌致病力和毒力相关基因表达的影响。研究发现，在白僵菌侵染不同阶段，肠道微生物多样性和群落组成呈现动态变化。侵染前期(侵染第1天)，肠道细菌种类有一个明显的增加过程，检测到的OTU(操作分类单元)数量增加，Chao指数也增加。至侵染中期(侵染第3天和第5天)，肠道细菌种类又经历了一个减少的过程，检测到的OTU数量减少，Chao指数也减少。至侵染末期(侵染第7天)，肠道样品中的微生物菌群OTU数量逐渐增加。与此相对应，不同侵染阶段肠道细菌群落组成也发生着动态变化。在未遭受白僵菌侵染(第0天)时，肠道细菌中最主要的细菌类群为厚壁菌门(Firmicutes)细菌，其次为变形菌门(Proteobacteria)细菌。在侵染第1天，厚壁菌门(Firmicutes)细菌相对丰度进一步上升，变形菌门(Proteobacteria)细菌的相对丰度明显下降。至侵染第3天时，厚壁菌门(Firmicutes)细菌相对丰度达到最大。随后，变形菌门(Proteobacteria)细菌的相对丰度缓慢上升，至侵染第7天时，其相对丰度达到最大，高于厚壁菌门(Firmicutes)细菌。变形菌门和厚壁菌门细菌在不同侵染阶段的肠道中呈现出不同演替变化，这种变化很可能这些类群的细菌在侵染过程中扮演的角色相关。研究还发现，白僵菌侵染的同时，接种P. agglomerans MG2，可以延长白僵菌的半致死时间LT50，降低幼虫死亡率。qPCR结果显示，接种P. agglomerans MG2显著抑制了球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchitl的表达，表明P. agglomerans MG2很可能通过抑制该基因的表达，减少白僵菌产生几丁质酶，从而阻止白僵菌穿透昆虫体壁入侵至昆虫体内。采用3kDa超滤管过滤，结合旋转蒸发仪蒸发收取馏分的方法，获得了P. agglomerans MG2培养上清液中具有白僵菌抑菌活性的组分，该抑菌活性组分为水溶性物质，但是GC-MC和LC-MC均未能鉴定出该活性组分结构。本项目研究结果为进一步阐明肠道微生物在宿主免疫防御病原真菌侵染中的作用以及肠道微生物对病原真菌的拮抗机制提供了理论依据