高迁移率族蛋白1在肝脏胰岛素抵抗中的作用及其原始释放机制的实验研究

Insulin resistance plays a major pathogenic role in the development of type 2 diabetes. Hepatic insulin resistance is considered as the origin of system insulin resistance. Both the previous clinic trials and our preliminary experiments showed the positive correlation between high-mobility group box 1 (HMGB1) and insulin resistance. However, the exact mechanisms are still obscure. The research findings from the other fields showed that Toll like receptor 4 (TLR4) is the major receptor of HMGB1. Our preliminary data exhibited that HMGB1 could significantly increase the expression of TLR4 in HepG2 cells, stimulating the downstream inflammation pathway and leading to insulin resistance. Thus, this project will employ 1) shRNA and specific inhibitors to inhibit HMGB1 expression in the liver; 2) recombination HMGB1 and gene overexpression aiming at HMGB1 to incrase HMGB1 expression; 3) TLR4 knockout mice to persue the role of HMGB1 on the hepatic insulin resistance and the mechanism about the initial release, which will be the theoretical basis for therapy aiming HMGB1 pathway in clinic.

胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要原因，而肝脏胰岛素抵抗被认为是全身胰岛素抵抗的起源。既往临床研究结果与我们的预试验均表明高迁移率族蛋白1（high-mobility group box 1, HMGB1）与胰岛素抵抗程度呈正相关，但机制尚不清。其他领域中的研究提示：Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）是HMGB1的主要受体之一。我们的预实验证明HMGB1可显著增强肝脏中TLR4活性，激活其下游炎症通路，引起胰岛素抵抗。由此，本课题拟通过1）HMGB1 shRNA及特异性抑制剂下调肝脏HMGB1的表达；2）携带HMGB1的腺病毒及重组HMGB1上调肝脏HMGB1的表达；3）使用TLR4敲除动物等手段，分别在动物整体水平及细胞水平中探讨HMGB1在肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制。同时还探讨HMGB1在肝脏的原始释放机制，为今后针对此信号通路的治疗提供线索和依据。

高迁移率蛋白1（HMGB1）是一种高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白，广泛存在于真核细胞核内。在特定情况下，HMGB1释放至细胞外，通过TLR4/NF-κB这一炎症通路启动炎症反应，在HMGB1释放的同时，其自身表达水平也相应升高，逐步对炎症进行级联放大。我们使用慢病毒过表达HepG2细胞内HMGB1后，发现过表达组，虽然细胞内有PA组较为一致的HMGB1增加，但是并没有出现胰岛素通路的受损，同步检测培养基上清内HMGB1含量发现过表达组并没有出现明显的增加，以上的实验结果提示无外界损伤刺激情况下，细胞内过量的HMGB1并不能引起胰岛素通路的改善或受损，并且过表达HepG2细胞HMGB1并不会引起其主动释放。本实验使用小干扰技术特异性下调HepG2细胞内HMGB1的表达用以研究其在胰岛素通路的作用，结果提示：单纯的敲除HMGB1并不能引起胰岛素通路的变化，然而，当在有PA处理的刺激情况下，siRNA-HMGB1组出现更加严重的胰岛素关键蛋白的受损，提示HMGB1在细胞内可能参与了某种保护作用。为了进一步证实细胞内外HMGB1发挥截然相反的生物学作用，我们分为rHMGB1处理组和rHMGB1处理siRNA-HMGB1的细胞组，结果同样证实了细胞外HMGB1导致胰岛素通路受损，细胞内的HMGB1在损伤刺激因素下参与减轻胰岛素通路的受损情况。.我们检测了PA处理下调HMGB1的HepG2细胞，结果提示，细胞内HMGB1的缺失加重了PA诱导的自噬活性下降，提示HMGB1在自噬活性中发挥重要作用，这种作用很可能是缺失了HMGB1的肝细胞胰岛素通路受损加重的原因。.综上，细胞内HMGB1在PA诱导的肝脏胰岛素抵抗中可能发挥保护作用，当机体内炎症等损伤刺激达到一定程度和时程后可导致肝脏内的HMGB1释放。一方面，细胞外的HMGB1维持和加重了炎症引起胰岛素通路的受损；另一方面，细胞内HMGB1的释放可能引起细胞内保护性自噬活性的下降，进一步加重了胰岛素抵抗。开发特定的抑制HMGB1释放药物，可能对高脂诱导的胰岛素抵抗有明显的延缓和减轻作用。