外生菌根分泌耐热蛋白的特性及其对过量重金属的固持作用和机制

Based on research results from this lab. on ecto-cell resistance mechanisms of ectomycorrhiza against heavy metal stress, the proposed study intended to provide sufficient evidences to approve a scientific hypothesis that, under heavy metal stress, ectomycorrhizal fungus may secrete glomalin-related protein, a kind of hot-resistant protein, to sequestrate heavy metal ions. Special extraction methods under high temperature will be installed to separate hot-resistant proteins from ectomycorrhizal fungus and their secretions, and further analysis will be done to determine the similarity of the extractions to glomalin-related protein by means of molecular biology and the protein's immunological response etc. The study will then test the characteristics of the extractions (molecular weight, sequence of ammonia acids, immunological responses to special proteins), and the content and distribution of heavy metal ions in the extractions under heavy metal stress. These studies will contribute to evaluate the mechanism and capacity of ectomycorrhizal fungus in sequestration of heavy metals through the secretions. Furthermore, characteristics of soil granular structure of the ecotomycorrhizal-rhizosphere will be tested on their formulation, stability, heavy metal contents and species in relation to the hot-resistant proteins, that will reveal the overall process of the ectomychorriza's resistance to heavy metal through affecting soil granular structure to change the bio-availability of the heavy metals, and in sequence, reduce the phytotoxicity.

根据本实验室在外生菌根真菌对过量重金属的细胞外抗性机理的研究成果，该项目提出，在重金属胁迫下，外生菌根真菌能够分泌对重金属具有高固持能力的类球囊霉素耐热蛋白的假设。拟通过特殊热提取方法提取菌根真菌和菌根分泌物中的耐热蛋白，利用分子生物学和蛋白免疫反应等技术手段，证明该提取物是与类球囊霉素相似的耐热蛋白。在此基础上，将测定分析该种耐热蛋白的分子量、氨基酸序列、蛋白质类型和对特异蛋白的免疫反应，以及过量重金属胁迫下该类蛋白中重金属的含量和分布，探索外生菌根真菌和菌根分泌物对重金属的固持能力和作用机制。研究菌根根际土壤中，土壤团聚体的形成、稳定性、团聚体种重金属固持量和形态与菌根分泌耐热蛋白的关系，探索菌根真菌通过影响土壤团聚体进而影响金属生物有效性，减少重金属生物毒害的机理。

本项目通过分子生物学方法，证明了外生菌根真菌可分泌具有固持重金属能力的耐热糖蛋白－类球囊霉素（glomalin homolog），该蛋白质存在菌丝表面及培养液中，是具有明显耐热性、疏水性的糖蛋白，与球囊霉素类似；研究了菌根真菌及接种油松分泌耐热蛋白的分子量、氨基酸序列等性质，发现外生菌根真菌分泌的耐热蛋白主要是一类分子量偏小（约为31 kDa）的耐热蛋白质，主要由肌动蛋白组成，其专一性氨基酸序列为“K.QEYDESGPSIVHR.K”，与丛枝菌根分泌的球囊霉素性质存在差异。接种油松分泌的耐热蛋白与外生菌根真菌分泌的耐热蛋白具有同源性；过量铜胁迫条件下，接种油松与外生菌根真菌分泌的耐热蛋白在特异性氨基酸序列上存在差异性，并尝试通过蛋白组和转录组学方法深入研究；通过接种外生菌根真菌，油松菌根分泌耐热蛋白增加了油松对过量铜和镉的固持作用；采用四种不同的外生菌根真菌接种油松，发现不同菌根真菌的接种对于增加油松铜耐受性的能力不同，接种除增加了寄主油松根系和茎叶生长，还显著增加了耐热蛋白的分泌总量，也对耐热蛋白的组分产生显著了影响，X.chrysenteron和P.tinctorius接种均阻止了铜向地上部分运输从而增强油松的铜耐受性。使用三维荧光与平行因子模型联用（EEM-PARAFAC）测定土壤中耐热蛋白的荧光特征，可表征土壤健康状况。本项目研究结果，增加了对菌根植物对过量重金属的耐受分子机制的理解，为利用菌根生物修复重金属污染土壤，提供了科学理论基础和技术支持。