墨旱莲多糖抗补体作用的物质基础与作用靶点研究

Immunosuppressant plays an irreplaceable role in organ transplantation and autoimmune disease treatment.Anti-complement immunosuppressive agents has become the research focus.Based on our initial work,polysaccharides from Eclipta prostrata L. have significant anti-complement effect,low anticoagulant effect and proved effect on EAE experimental animal model test,which indicated that the polysaccharide from Eclipta prostrata L.is a potential inhibitor of conplement system.Therefore to clarify the anticomplement material basis and tagarts is very import.In this project, homogeneous anticomplementary polysaccharide will be obtained by activity tracking separation method and their structural features will be characterized.Its influence pathway and action targets will be clarified through in vitro anti-hemolysis experiments and its pharmacological effects will be investigated by observe the influence of the incidence of mouse cytokine expression through the immune animal model experiment. The research results will establish the foundation for develop the polysaccharide from Eclipta prostrata L.as anti-complement immunosuppressant.

免疫抑制剂在器官移植、自身免疫性疾病治疗方面发挥着不可替代的作用，其中针对补体系统的免疫抑制剂已成为当前研究的热点。我们前期的研究发现墨旱莲多糖具有显著的抗补体作用和低抗凝作用，并且其对小鼠自身免疫性脑脊髓炎亦有良好的干预作用，显示墨旱莲多糖具有针对补体系统的免疫抑制剂的潜力,其抗补体作用的物质基础和具体的作用靶点的阐明具有十分重要的意义。本项目拟采用活性跟踪的策略，通过系统的分离纯化获得抗补体活性显著的均一多糖，确定其结构特征，阐明墨旱莲多糖抗补体作用的物质基础，然后从补体系统激活的三条途径中确定其作用的靶点，并采用小鼠自身免疫性脑脊髓炎模型评价均一多糖的药理作用,以期为墨旱莲多糖开发为针对补体系统的免疫抑制剂奠定基础。

本课题对墨旱莲多糖进行了以抗补体活性为导向的系统的分离纯化，获得了三种具有显著抗补体活性的均一多糖EAP20-1、EAP20-2和EAP20-3。重点对EAP20-1和EAP20-2进行了结构分析，明确了EAP20-1和EAP20-2均是由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。其中EAP20-1的分子量为5.2kDa，主链含β-D-1,4-Gal， β-D-1,6-Gal， α-L-1,4,6-Glc，并含有少量的α-L-1,5-Araf。EAP20-2分子量为6.3kDa，主链由β-D-1,4-Gal， β-D-1,6-Gal，α-L-1,4,6-Glc组成，并含有少量的α-L-1,4-Glc。对EAP20-1和EAP20-2抗补体作用的具体分子靶点进行了确认表明EAP20-1和EAP20-2均作用于补体C1q、C1r、C1s、C2、C4、C5、C7和C9组分，且不具有抗凝血的副作用，提示这两种墨旱莲多糖具有开发为补体抑制剂的潜力，并有望用于治疗与补体过度激活有关的疾病如多发性硬化等。采用自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型评价墨旱莲多糖的治疗作用发现墨旱莲粗多糖、EAP20-1和EAP20-2均可以有效改善EAE小鼠的临床症状。深入探讨EAP20-1治疗EAE的生物学机制发现： EAP20-1给药后小鼠脊髓的炎性基因如IL-17，TNF-α，IL-1β，iNOS等的表达量远低于模型组小鼠，结果具有显著性差异。Th17细胞是参与EAE发病的非常重要的一类T细胞亚群，它通过分泌IL-17等细胞因子造成血脑屏障损伤并导致炎性细胞进入中枢神经系统从而引起炎性脱髓鞘病变。我们发现EAP20-1组小鼠脾脏RORγt、IL-17A、IL-22基因的表达显著降低，而这些基因都是影响Th17细胞分化和功能的关键基因，这提示EAP20-1可能抑制Th17细胞分化。通过流式细胞术分析验证了EAP20-1给药组小鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞比例要明显低于模型组，而在体外细胞因子诱导的Th17细胞分化实验中，不同剂量的EAP20-1处理可以抑制Th17细胞的分化，显著降低细胞上清液中的IL-17浓度，表明EAP20-1可以直接抑制Th17细胞的分化。综合以上结果，本研究为后期将墨旱莲多糖及其均一多糖开发为新型补体抑制剂以及针对多发性硬化疾病的治疗药物奠定了坚实基础。