小麦新种质N9134抗白粉病相关基因的克隆及功能研究

New wheat germplasm N9134, carrying powdery mildew resistance gene PmAS846 of wild emmer, is highly resistant or immune to powdery mildew mixed strains in Guanzhong region of Shannxi Province, is an ideal material to dig wheat powdery mildew resistance genes. This project based on the preliminary results of expression profiles of N9134 induced by powdery mildew E09, further analysize the signaling pathways of N9134 resistance to powdery mildew, is aimed at excavating the key genes in wheat powdery mildew resistance signal network, and at revealing their resistance mechanism. We using electronic cloning and cDNA ends to rapidly amplificate and separate the target genes, and to predict their structure and function. Using the Western hybridization, subcellular localization and quantitative real-time PCR to identification of expression characteristics and patterns of new genes, then to further reveal their action mechanism in the process of resistance to powdery mildew. On the basis of the above, employ virus induced gene silencing and the overexpression technology to further analysize and validate the biological function of target genes. This project is expected to obtain five to eight wheat powdery mildew resistance genes, to clarify their mechanism in the process of N9134 resistance to powdery mildew, and thus to enrich genetic resources of wheat powdery mildew resistance, and to provide basic data and references for researching resistance mechanism of wheat powdery mildew.

小麦新种质N9134携带来源于野生二粒小麦的抗白粉病基因PmAS846，对陕西关中地区白粉病混合菌均表现高抗至免疫，是挖掘小麦抗白粉病相关基因的理想材料。本项目基于前期N9134受白粉菌E09诱导后的表达谱研究结果，进一步分析N9134抗白粉病的信号通路，旨在挖掘小麦抗白粉病信号网络中的关键基因，并揭示它们的抗病机制。利用电子克隆与cDNA末端快速扩增、分离目的基因，采用生物信息学分析预测目的基因的结构与功能，通过Western杂交、亚细胞定位、实时定量PCR全面鉴定新基因的表达特性和模式，进而揭示它们在抗白粉病过程中的作用机制。在此基础上，采用病毒诱导基因沉默和过表达技术进一步分析、验证目的基因的生物学功能。本项目有望获得小麦抗白粉病的相关基因5-8个，并阐明它们在N9134抗白粉病过程中的作用机制，从而丰富小麦抗白粉病的基因资源库，为小麦抗白粉病机制研究提供基础资料和依据。

小麦是我国重要的粮食作物。伴随全球气候变暖，小麦白粉病发生频繁，极大地威胁小麦的安全生产。防治小麦白粉病的有效途径是培育抗性品种。本研究基于N9134抗白粉病的芯片表达谱数据和转录组学数据，挖掘具有抗病结构域的基因序列，采用电子克隆、RACE技术，以及同源克隆等方法，获得了5个小麦抗白粉病相关基因。利用生物信息学分析网站，进行了基因结构的预测和序列的特征分析；通过RT-PCR、原核表达、亚细胞定位、基因沉默和转化拟南芥等技术，验证了目的基因在小麦抗白粉病过程中的功能。通过四年的执行，完成了项目的全部研究内容，并得到如下结果：①通过对乌拉尔图小麦基因组蛋白序列进行再次筛选，获得485个小麦NB-ARC 家族基因，即为：262个N 型，163个CNL 型(其中CN 型34)，60个NL 型，无Tir型。②利用电子克隆与RACE技术相结合的方法，获得了TaRPM1基因的cDNA全长序列，RT-PCR结果表明，TaRPM1基因在小麦叶片中高量表达，在接种白粉菌48h时，表达量最高；到接种白粉菌120h时，还将维持较高的表达量。利用最新公布的小麦基因组数据，采用电子定位的方法，将TaRPM1基因定位在了3D染色体上。③通过同源克隆，获得了TaPRX108和TaChitinase2基因的cDNA全长序列，TaPRX108基因沉默后或过表达，均表明TaPRX108基因参与了抗白粉病过程。④利用同源克隆技术，获得了TaMAPK10-like基因的cDNA全长序列。序列分析表明，该基因与山羊草蛋白激酶MAPK10-like基因相似性最高；采用 His-Trap HP 亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，电泳检测在70 kDa有单一条目的带；融合蛋白 TaMAPK-hGFP 在细胞质高强度表达。TaMAPK10-like基因沉默和转化拟南芥结果均表明，TaMAPK10-like基因参与了抗白粉病过程。⑤通过同源克隆，获得了TaMKK2基因的cDNA全长序列。进化树分析表明，TaMKK2基因与山羊草的MKK2-like基因亲缘关系紧密；通过37℃ 0.2mM IPTG诱导进行放大培养，包涵体清洗后Ni柱纯化复性后得到目的蛋白。然而，在亚细胞定位时，未检测到荧光信号，研究结果不仅丰富了小麦抗白粉病的重要基因资源，也为今后小麦抗病育种提供科学依据，对提升目前小麦的抗病性具有重要意义。