TRPV4通道调节中性粒细胞活化介导心肌缺血再灌注损伤的机制研究

Neutrophil activation (infiltration and degranulation) plays an important role in the process of initiation and aggravation of myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). Although TRPV4 channel is known to be involved in the inflammatory response of various diseases, its role in the activation of neutrophils during MIRI is still unknown. Our preliminary studies found that the function of TRPV4 on neutrophils significantly enhances during MIRI, while its expression remains unchanged, and the neutrophil infiltration was significantly reduced in TRPV4-/- mice. In addition, activation of neutrophils induced by platelet activating factor (PAF) indicate the Ca2+ influx, and generation of reactive oxygen species (ROS) and myeloperoxidase (MPO) , and those effects can be blocked by TRPV4 inhibitors. Based on the above results, we hypothesized that during MIRI, activated TRPV4 on neutrophils induced cardiomyocytes injury through increasing in [Ca2+]i and production of ROS and MPO. By establishing the mice and cell MIRI models, the PAF induced neutrophil activation model, using TRPV4-/- mice as well as TRPV4 antagonits/agonists, we will explore molecular basis of MIRI mediated by TRPV4 channel on neutrophils. The results are expected to provide the new target of clinical treatment of MIRI.

中性粒细胞活化（浸润和脱颗粒）是启动和加剧心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的重要机制。已知TRPV4通道参与多种疾病炎症反应过程，但TRPV4是否调节中性粒细胞活化参与MIRI尚不明确。我们预实验发现：MIRI后中性粒细胞上TRPV4表达不变但功能显著增加；TRPV4基因敲除后其浸润明显减少；另外，血小板活化因子（PAF）诱导的中性粒细胞活化结果表明：Ca2+内流，氧自由基（ROS）和髓过氧化物酶（MPO）产生可以被TRPV4抑制剂所阻断。因此我们推测在MIRI中，中性粒细胞上TRPV4功能增强，可通过升高[Ca2+]i活化PMN、促进ROS和MPO的释放导致心肌细胞损伤。因此本研究拟建立小鼠和细胞MIRI模型，及PAF活化中性粒细胞模型，利用TRPV4-/-小鼠、TRPV4阻断/激动剂，观察PMN上TRPV4如何参与MIRI的发生和发展，探索其分子机制，为临床防治MIRI提供新的治疗靶点。

目的：中性粒细胞（PMN）活化是启动和加剧心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的重要机制。我们前期研究发现阻断/基因敲除 TRPV4 后可明显减少小鼠 MIRI 后心脏组织中 PMN 的浸润，并减轻心肌损伤。多项研究表明 TRPV4 参与多种疾病的炎症反应过程，但 TRPV4 是否通过调节 PMN 活化参与 MIRI 仍不清楚。在本研究中，我们探讨了 TRPV4 是否参与调节 PMN 的活化并初步研究了 PMN 上TRPV4 参与小鼠 MIRI 的机制。.结果：小鼠 PMN 上有 TRPV4 的蛋白表达，TRPV4 主要表达于 PMN 细胞膜表面。PMN 细胞膜上可记录到 GSK790A 诱导的 TRPV4 电流，且细胞钙荧光显示GSK790A 可浓度依赖性的诱导 PMN [Ca2+]i 增加。同时，这些效应可被 TRPV4阻断剂或TRPV4 基因敲除所减轻或消除。进一步研究证实TRPV4 激动剂 GSK790A 可以增加 PMN 的 ROS 水平、促进 NETs 的释放以及 MPO 的分泌等，且这些效应可被 TRPV4 阻断剂或 TRPV4 基因敲除所抑制。此外，我们发现阻断 TRPV4 可减少 PMN的趋化。活化 TRPV4 后的 PMN 可进一步加重心肌损伤。我们进一步探索了相关信号分子在TRPV4介导的PMN活化中的作用机制。GSK790A显著上调了PKCα、P38和AKT的磷酸化水平，这些激活作用被TRPV4抑制剂预处理所阻断。随后结果提示P38和PKCα的激活依赖于TRPV4的Ca2+流入，但AKT激活需要TRPV4介导的胞内Ca2+释放。另外我们采用PKCα抑制剂、P38抑制剂或AKT抑制剂可显著减轻了GSK101诱导的ROS产生。以上结果表明：活化的TRPV4介导的Ca2+信号主要通过PKCα、P38和AKT参与中性粒细胞中ROS的产生。.结论：小鼠 PMN 上存在 TRPV4 的功能性表达，且 TRPV4 参与调节 PMN 的趋化、ROS 和 NETs 生成、MPO 的释放等多个活化过程，其作用机制主要为TRPV4介导的Ca2+信号主要通过PKCα、P38和AKT参与PMN中ROS的产生。因此，PMN 上的 TRPV4 参与 MIRI 的发病过程，有望成为 MIRI新的有效治疗靶点。.