军团菌VI型分泌系统的表型功能及调控通路研究

Legionella is the pathogen of Legionnaires' disease. Legionella is widely found in various water systems. It can survive and proliferate in the free living amoeba and human macrophages, which can lead to the occurrence of disease. Secretion systems are its main virulence islands. Legionella have five kinds of secretion systems, however the phenotype and gene regulation of the IVA (T4ASS) and VI type (T6SS) secretion systems are still poorly understood. Especially, the T6SS in Legionella was recently discovered by our research group. In this study, the operon structure of T6SS cluster will be confirmed through the quantitative reverse transcription PCR. The phenotypic effects including the in abilities of growth at various temperatures, biofilm formation, intracellular growth in amoeba, lethality against mice, cytotoxicity, cell adhesion and invasion ability will be systematically characterized for T6SS of Legionella; The deletion mutants will be constructed for RpoS and different regulatory pathways, and then the primer extension, LacZ fusion reporter, protein expression and purification, gel mobility shift, and DNase I footprinting assays will be then carried out to characterize the trancscriptional regulation of T6SS genes by the Rpos master regulators and each core regulators. The final combined phenotypic and molecular dataset will promote us to gain the deeper understanding of distinct phenotpes and RpoS-mediated cell regulation of T6SS expression in Legionella.

军团菌是军团菌病的病原体，广泛存在于各种水体中，能在自然环境中的阿米巴以及人巨噬细胞内生存繁殖，从而引起疾病的发生。分泌系统为其主要的毒力岛。军团菌表达五类分泌系统，其中IVA型（T4ASS）和VI型（T6SS）分泌系统的具体功能及其基因调控机制均不甚明确，尤其是T6SS是我们课题组最近在基因组分析中首次发现。在本研究中，用逆转录荧光定量PCR的方法确定 T6SS基因簇操纵子结构。分析T6SS在不同温度下体外生长能力、生物膜形成、阿米巴原虫内生长、小鼠毒力、细胞毒性、细胞的粘附侵袭和胞内生长能力等环境生存及致病性方面的功能表型效应；通过构建核心调控子RpoS和不同调控通路的缺失株，进而开展引物延伸实验、LacZ 报告基因融合实验、蛋白表达纯化及Western blot、凝胶阻滞实验、DNase I 足迹实验，探究代谢调控系统核心调控子RpoS调控 T6SS基因转录的具体通路和精细分子机制。

军团菌病是上世纪70年代末发现的一种新发传染病，其致病菌是军团菌。军团菌病的主要症状是非典型肺炎，病死率在30%左右。目前已知的军团菌属有70余个种，其中21种已被确认与引起人类疾病有关。军团菌分泌系统是其主要的致病岛。目前有报道的军团菌分泌系统有I型、II型、IVA型、IVB型。其中T2SS 和T4BSS已明确与毒力相关。我们在之前的研究中在国际上首次报道了军团菌的VI型分泌系统（T6SS）。通过基于全基因组测序的种群结构分析和细胞内生长能力检测，发现不同克隆群、不同毒力表型的菌株均含有T2SS和T4BSS，但是在T4ASS和T6SS的分布上有差异。其中T6SS是首次在军团菌中被发现。我们在3个种的军团菌（L.dumoffii、L. cherrii、L. gormanii）中发现了T6SS。另外，军团菌的毒力受3个双组分系统（CpxRA、PmrAB、LetAS）和1个密度感应系统（LqsRS）调控。首先用逆转录荧光定量PCR的方法确定 T6SS基因簇操纵子结构。通过构建T6SS基因缺失和回补菌株，分析T6SS在不同温度下体外生长能力、生物膜形成、小鼠毒力、细胞毒性、细胞的粘附侵袭和胞内生长能力等环境生存及致病性方面的功能表型效应；通过构建核心调控子RpoS和不同调控通路的缺失株，进而开展精细调控实验，探究代谢调控系统核心调控子RpoS调控 T6SS基因转录的具体通路和精细分子机制。我们发现PmrAB通路调控T6SS分泌系统基因表达，对调控军团菌细胞内生长能力起重要作用。.此外，新建了拉曼光谱鉴定技术、不依赖培养的SBT分型、基因组分型技术，在国家致病菌识别网中推广应用，用于鉴别环境水体中的高致病性嗜肺军团菌，作为军团菌病感染和暴发预警，以及开展水体消毒的依据。阐述了军团菌的流行传播以及耐药特征。建了基于毛细管电泳、液相芯片及荧光定量PCR多重呼吸道病原体检测技术用于社区获得性肺炎监测, 揭示包括军团菌在内的呼吸道病原体在环境、人群中的流行机制。在国际上率先发现病毒性肺炎患者鼻咽部存在超级优势菌属Super-dominant pathobiontic bacteria( SDPG)，并揭示SDPG是引起继发性下呼吸道和血流细菌感染的来源，为病毒性肺炎重症化病原学机制研究提供新的思路。