免疫检查点蛋白VISTA在Imiquimod 诱导的银屑病样皮肤炎症的作用及机制研究

V-domain Ig Suppressor of T cell Activation(VISTA) is a novel immune-checkpoint, which is a homolog of PD-1, plays important role in tumor immunotherapy and autoimmune disease. Psoriasis is a chronic inflammatory disease accompanied by keratinocyte hyperproliferation and leukocyte infiltration. To determine whether VISTA regulates psoriasis, we compared skin responses of VISTA ko mice and wide type controls in an imiquimod (IMQ) –induced murine model of psoriasis. VISTA ko mice showed severe epidermal hyperplasia, greater neutrophilic infiltration, and higher expression of Th17 cytokines (versus WT mice). In this project, we will use the flow, immunohistochemistry, ELISA, PCR and western blot techniques to study the mechanism of VISTA in regulation of psoriasiform dermatitis, especially maybe through expression on γδ T cell and induce the IL-17/IL-22 signaling cascade. Furthermore, VISTA suppressed T cell activation by T cell receptor signaling pathway was also studied and to identify the binder of VISTA.

V-domain Ig Suppressor of T cell Activation (简称VISTA) 是新型免疫检查点，与程序性细胞死亡蛋白PD-1有同源性，在肿瘤免疫治疗及控制自身免疫性疾病中发挥重要作用。银屑病已被定义为器官特异性自身免疫性疾病。我们采用咪喹莫特分别诱导野生型和VISTA ko小鼠产生银屑病样皮肤损伤，VISTA ko 小鼠表现为更严重表皮异常增殖及炎症浸润，表达较高Th17细胞相关因子。针对这一表型，本项目拟采用多色流式技术，固相免疫沉淀，PCR和ELISA等，从整体、细胞、分子水平研究VISTA在银屑病中的机制，揭示VISTA在皮损区不同免疫细胞的表达及对IL-17/IL-22轴炎症级联反应的调节，进一步的，解析VISTA在T细胞受体（TCR）信号通路作用引起T细胞反应及可能的结合靶标蛋白。

银屑病是一种慢性炎性皮肤病，与免疫系统紊乱有重要关系。VISTA是一种新型免疫检查点，在银屑病中发挥重要作用。本项目采用单细胞测序技术研究VISTA KO小鼠银屑病样皮损区单细胞转录组情况，从免疫细胞图谱层面，结合免疫组化/免疫荧光等技术揭示VISTA在银屑病中的作用机制。另外，针对VISTA的靶标蛋白VSIG3，进行其晶体结构研究。.本项目主要发现包括：（1）与野生型小鼠相比，HE染色结果表明VISTA KO小鼠发展为更严重的银屑病样炎症皮损和免疫细胞浸润。单细胞测序结果表明，在23258个单细胞中，确认了12个主要细胞亚型，包括：巨噬细胞、树突状细胞，中性粒细胞、T细胞、成纤维细胞、NK细胞等。其中，巨噬细胞在野生型和VISTA KO小鼠中占比最大，而树突状细胞和成纤维细胞数量在VISTA KO小鼠中显著升高。组间差异表达基因分析表明，与伤口修复相关基因Hspb1和炎症反应相关基因Cebpb在银屑病样VISTA KO小鼠皮损区中表达水平显著升高。（2）分子、细胞、动物实验结果表明，VISTA蛋白激动剂M351-0056可以增强VISTA蛋白的功能，抑制外周血PBMC和CD4+T 细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-17A和TNF-α）分泌，促进CD4+ Foxp3+T细胞表达，并且可以抑制JAK2-STAT2通路磷酸化。银屑病小鼠口服VISTA激动剂M351-0056（ 25 mg/kg）后，耳厚度较模型组显著降低，H&E染色表明耳朵和背部皮损处的表皮厚度显著降低，皮损处IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-17的mRNA及蛋白表达水平显著下降。（3）使用大肠杆菌系统表达VSIG3胞外段蛋白，通过蛋白变性、镍柱纯化与复性手段，获得目的蛋白，再通过分子凝胶层析柱得到蛋白单体，经过气相扩散悬滴法筛选蛋白结晶条件，显微观察结合X-ray晶体衍射获得VISTA配体VSIG3的晶体结构。.综上，利用单细胞测序技术，表明VISTA主要通过巨噬细胞调控银屑病，并且获得VISTA调控银屑病相关的新型基因，靶向巨噬细胞上VISTA是银屑病治疗的潜在靶标。VISTA配体VSIG3晶体结构的解析，为VISTA/VSIG3通路的化合物设计提供了结构生物学基础。因此，本项目为探索银屑病治疗的发病机制、寻找新型治疗方案和联合用药提供了理论依据。