淋巴管内皮细胞形成机制与卵巢癌淋巴结定向转移的关系研究

定向淋巴结转移是卵巢癌发生转移重要途径之一。本课题利用自主建立的具有淋巴结不同转移能力卵巢癌细胞和动物模型，以卵巢癌细胞株SKOV-PM和人淋巴管内皮细胞HLEC为对象，通过体外共培养和条件培养基交互培养实验，观察不同微环境下SKOV-PM和HLEC细胞超微结构、运动、转移侵袭能力的影响。通过裸鼠爪垫荷瘤动物模型结合活体荧光成像技术，动态观察体内荧光标记的卵巢癌细胞迁移的时间和顺序，并对淋巴结转移组和非转移组裸鼠卵巢癌原发灶、癌旁及淋巴结组织，采用激光共聚焦显微镜、电镜、流式细胞仪、免疫组化、Western blot、基因表达谱芯片等技术，确定新生淋巴管的形成与定位，观察淋巴结转移过程细胞内活性氧浓度、pH值、细胞表面离子通道、细胞因子等微环境改变，检测上皮细胞间质转化、融合细胞形成等超微结构情况，筛选出促进淋巴管内皮细胞形成的关键分子，明确淋巴管内皮细胞的形成在卵巢癌淋巴结定向转移作用。

本课题以具有淋巴结不同转移能力卵巢癌细胞和动物模型及人血管内皮HUVEC细胞和淋巴管内皮细胞HLEC为研究对象，建立荧光标记的各种细胞,分别收集其培养基上清，作为交互培养的条件培养基，采用两种细胞交互培养与共培养的模式，研究共培养后各组细胞的生物学特性。结果发现，与单独培养的细胞相比，条件培养基交互培养后的SKOV3-PM4细胞伪足增多、核分裂像增多，生长速度增快, G1期的细胞比例降低，G2、S期的细胞比例升高；采用条件培养基交互培养后HUVEC出现空泡化超微结构，生长速度略低于单独培养细胞，G1期的细胞比例升高，G2、S期的细胞比例降低。共培养的SKOV3-PM4和HUVEC细胞在激光共聚焦显微镜下可见两种细胞的融合现象；明胶酶谱分析显示，基质金属蛋白酶-2在单独的SKOV3-PM4细胞中低表达，在共培养的细胞中高表达。同时采用抗体芯片和iTRAQ蛋白组学方法检测各组细胞的细胞因子和筛选差异的分泌蛋白，并在人血清和细胞培养基中进行验证。发现共培养后有39个细胞因子发生改变，其中GRN、GM-CSF、BD-1、VEGFA等34个细胞因子表达上调，SPARC、IGFBP7等5个细胞因子表达下调；经ELISA方法在卵巢癌、良性肿瘤及正常人血清中验证发现VEGFA、IGFBP7差异有统计学意义，VEGFA在恶性组表达最高，正常组表达低；IGFBP7的表达在正常组中表达最高，恶性组中表达低。VEGFA、GRN的表达上调及SPARC、IGFBP7的表达下调与卵巢癌淋巴结定向高转移密切相关。 结合活体荧光成像技术，动态观察体内荧光标记的卵巢癌细胞迁移的时间和顺序，并确定新生淋巴管的形成与定位及上皮细胞间质转化等超微结构变化。结果表明：与SKOV3细胞组比较，接种SKOV3-PM4细胞裸鼠的淋巴结转移率较高，转移灶出现在第5周。其微淋巴管MLVD、 VEGF-C和 VEGFR-3在SKOV3-PM4表达量显著增多。透射电镜观察到瘤组织边缘区的新生淋巴管基膜不完整，断裂，造成内皮细胞与癌细胞直接接触，并存在染色质边集，溶酶体增多，线粒体等亚细胞结构出现嵴断裂，空泡化等损伤性超微结果改变。卵巢癌定向淋巴道转移与新生淋巴管的生成相关，VEGF-C/VEGFR-3信号轴、VEGFA、IGFBP7是促进淋巴管内皮细胞形成的关键分子，有可能作为卵巢癌淋巴结定向转移诊断和治疗的标志物。