HMGN2分子抗乙型肝炎病毒作用的研究

乙型肝炎病毒（HBV）是一种典型的非细胞毒病毒，肝炎的发生是由于抗原特异性的抗病毒细胞免疫反应引起的。研究发现，机体还存在一种非细胞毒的抗HBV的重要保护机制，CD8＋T细胞可分泌一类可扩散分子─CD8抗病毒因子，但其分子基础尚未确定。申请者研究发现HMGN2是LAK细胞（包括CTL和NK细胞）一个新的免疫效应分子，本项目在已有预试验结果的基础上，将在HepG2.2.15细胞模型以及动物模型上全面深入评估HMGN2的抗乙型肝炎病毒作用；试验确定HMGN2抗HBV的作用机制及其作用靶点；检测并确定在乙肝病毒抗原刺激下HMGN2增强表达和分泌的淋巴细胞亚群。研究的预期结果将确定HMGN2是否CTL细胞抗病毒作用的活性分子，并确定其作用机制，将有助于进一步阐明机体抗肝炎病毒免疫保护的分子机制。

申请者研究发现HMGN2是LAK细胞（包括CTL和NK细胞）一个新的免疫效应分子，本项目研究首先成功构建了HMGN2分子的原核表达载体，分离纯化了重组表达的HMGN2蛋白，并对纯化的HMGN2蛋白进行鉴定及活性检测；同时从人单核细胞中大量提取天然HMGN2分子，原核表达的和天然存在的HMGN2分子同时用于做后续的功能实验研究。在HepG2.2.15细胞模型和动物模型中，实验证明HMGN2分子具有较强的抗HBV活性，HMGN2蛋白（100-1μg/ml）对HBeAg分泌有一定抑制作用，在5μg/ml浓度作用72小时其抑制率可达40%；HMGN2蛋白对HBsAg分泌亦有一定抑制活性；同时，HMGN2可使HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA的拷贝数降低，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。分别抽提HMGN2分子作用后HepG2.2.15细胞的总RNA和HBV复制中间体DNA，以地高辛标记的HBV重组质粒pHBV4.1位探针，分别进行Northern及Southern杂交，实验确定HMGN2分子对HBV转录与复制水平都有抑制作用活性。HBV DNA聚合酶是研究HBV感染规律和观察药效的敏感指标，采用微量直接法检测HMGN2作用的HBV阳性血清中HBV DNA聚合酶活性，检测HMGN2分子对血清中HBV DNA聚合酶（HBV-DNAP）是否具有抑制作用及其抑制百分率。实验结果证明了HMGN2蛋白抗乙肝病毒作用 HMGN2蛋白对乙肝病毒的DNA聚合酶有抑制作用。同时，实验证明HMGN2蛋白对Tca8113细胞具有强抑制作用，能够诱导Tca8113细胞的凋亡；Western-blot实验检测Tca8113凋亡蛋白的表达，结果显示：Tca8113细胞经HMGN2蛋白作用后，细胞总蛋白中凋亡促进蛋白Bax、P53表达量增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达量减少，Caspase-3表达量减少。体内裸鼠动物试验也证明HMGN2蛋白能明显抑制肿瘤生长，HE染色可见细胞坏死。流式细胞分选仪从人血液细胞中分离培养人CD8+ T细胞和NK细胞，检测HMGN2分子的定位和表达情况。结果显示NK细胞可分泌和表达HMGN2分子。本研究实验证明HMGN2可能是NK细胞抗病毒和抗肿瘤细胞的活性分子。