不同温度对KCNQ2通道蛋白胞内转运的影响及其机制研究

The voltage-gated potassium channels Kv7.2 encoded by KCNQ2 gene is mainly expressed in the central nervous system, and its mutation have been identified to cause not only the highly self-limited benign familial neonatal - infantile convulsions (BFNIC) but also severe and debilitating presentations. Therefore, the study on regulatory mechanism of KCNQ2 potassium channel is important to the pathogenesis of neonatal epilepsy and design of drugs. Previous studies have confirmed that the temperature can affect electrophysiological activity and intracellular trafficking of KCNQ2 potassium channel, but the exact mechanism remains to be substantiated. This study based on the early studies sought to investigate the impact of temperature on the expression and function of KCNQ2 channels by using the transfected cells, brain slices and epilepsy rat model. Our studies focus on potential regulation of temperature on trafficking of KCNQ2 protein and explore the relationship of the key structural sites and the function of KCNQ2 channel that is important to understand the pathogenesis of neonatal epilepsy and design of drugs.

KCNQ2基因编码的电压依赖型钾离子通道Kv7.2主要在神经系统中表达，其突变不仅可以引起高度自限性的良性家族性新生儿-婴儿惊厥(BFNIC)，还可以表现为严重的癫痫性脑病，KCNQ2基因由此也被认为是癫痫的易感基因之一。因此，研究KCNQ2通道的调控对于研究新生儿癫痫的发病机制及相关药物研发的意义重大。本课题前期的研究已经证实温度升高可以影响KCNQ2通道的电生理特性及蛋白的胞内转运，但对温度升高引起KCNQ2通道蛋白胞内滞留的具体机制还不清楚。本课题拟在此研究的基础上进一步深入，通过体外转染细胞、脑片培养及动物模型三个层次，研究不同温度对KCNQ2蛋白膜上表达和功能的影响并寻求对温度最为敏感的突变位点，试图阐明不同温度对KCNQ2通道蛋白胞内转运的影响及其具体机制并探讨KCNQ2通道关键结构位点对功能的影响，为新生儿癫痫的发病机制及相关药物研发提供理论依据和实验基础。

本课题按照实验计划，通过质粒构建，体外细胞实验以及热性惊厥动物模型的建立及检测，完成课题原定计划目标。课题组研究发现温度上升可以促进KCNQ2蛋白的表达，但是KCNQ2膜蛋白表达并未增加。课题组成功构建孔区截短突变载体KCNQ2-SF，并转染细胞。体外细胞实验发现温度升高后，截短突变型（KCNQ2-SF）通道的荧光强度没有增加，荧光共定位分析结果膜表面的突变型通道（KCNQ2-SF）的比例也没有改变，提示选择性过滤器区域可能是影响KCNQ2通道蛋白转运过程中的重要影响因素。课题组成功建立小鼠热性惊厥动物模型，并发现高热惊厥组小鼠海马组织中KCNQ2基因的mRNA表达水平较正常对照组的表达有所升高。高热诱导后，小鼠皮质和海马中KCNQ2蛋白表达量增加，同时惊厥活动脑电波更为明显。课题组研究发现对动物模型注射KCNQ通道抑制剂后，惊厥小鼠癫痫样惊厥活动脑电波更为明显，小鼠惊厥发作的潜伏期明显缩短，惊厥持续时间明显延长，同时发作温度显著降低。组织学研究同时发现小鼠海马CA3区神经元排列松散，极向紊乱，细胞数量减少，组织间水肿明显。课题组也发现注射KCNQ通道抑制剂对惊厥小鼠海马组织的凋亡没有明显影响，但是小鼠海马组织中KCNQ3表达的阳性率明显降低，染色强度也有所减弱。提示KCNQ通道抑制剂在惊厥过程中不仅通过KCNQ2通道，也可能通过KCNQ3通道发挥作用。本课题研究成果可能为新生儿癫痫的发病机制及相关药物研发提供理论依据和实验基础。