SiRNA复合HA/TCP多孔支架构建成骨基因干预功能材料的探索性研究

Bone substitute plays a role of guiding bone tissue growth, the process of which is strictly regulated by genes. SiRNA has been found to silence targeting gene mRNA precisely. RNA intererence against negative regulating gene in bone formation can incite cell potential capability and improve the rate and quality of bone formation. Plekho1 gene and coded protein regulate bone phenotype negatively. SiRNA of Plekhol gene can enhance bone formation without influencing osteoclast. HA/TCP scaffold has the characters of osteoconduction and degradability. SiRNA is incorborated into scaffold by gel and freeze-drying method. SiRNA is released in vivo and scilence Plekho1 precisely, turning the scaffold into a gene funtional bone substitue. (AspSerSer)6 molecular targeting bone formation area is used to adhere siRNAs at these areas and transfect osteoblast targetedly and safely. Cell experiment and in vivo test are adopted to evaluate transfection efficacy bone formation and side effect of the novel material. This project is aimed to find a new path in the research of bone substitute.

骨替代材料在体内扮演着引导骨组织再生的角色，骨再生过程受到成骨相关基因的严格调控。SiRNA被发现具有精确沉默目标基因mRNA的能力，针对负调控成骨基因实施RNA干扰，可以高效发挥成骨潜能，提高骨再生的速度和质量。Plekho1基因及其所编码的蛋白具有负调控成骨功能的作用,其siRNA可以高效沉默该基因表达及蛋白翻译，从而促进骨形成，同时不影响破骨细胞的功能。大量研究说明HA/TCP支架材料具有一定骨传导能力和可降解性，结合凝胶体系通过冷冻干燥工艺制备复合siRNA支架，植入体内可缓慢释放siRNA对原位成骨细胞Plekho1基因实施精确沉默, 使之成为一种全新意义的基因干预功能材料。同时采用(AspSerSer)6提高siRNA作用的靶向性及安全性。本课题对siRNA复合材料的转染效率、促进成骨效应、不良影响及临床应用前景等进行探索性研究，将为骨替代材料研究提供新思路。

骨替代材料在体内扮演着引导骨组织再生的角色，骨再生过程受到成骨相关基因的严格调控。siRNA被发现具有精确沉默目标基因mRNA 的能力，针对负调控成骨基因实施RNA干扰，可以高效发挥成骨潜能，提高骨再生的速度和质量。Plekho1基因及其所编码的蛋白具有负调控成骨功能的作用，其siRNA可以高效沉默该基因表达及蛋白翻译，从而促进骨形成，同时不影响破骨细胞的功能。大量的研究证明，异种煅烧骨具有一定骨传导能力和可降解性，结合凝胶体系通过冷冻干燥工艺制备复合siRNA 支架，植入体内可缓慢释放siRNA，对原位成骨细胞Plekho1基因实施精确沉默，使之成为一种全新意义的基因干预功能材料。同时采用(AspSerSer)6 提高siRNA作用的靶向性及安全性。首先设计合成了Plekhol的siRNA以及(AspSerSer)6 靶向分子。同时进行了脂质体的合成，并将脂质体与(AspSerSer)6靶向分子耦合。耦合后进行siRNA的包裹。将包裹后的siRNA对大鼠成骨细胞进行转染，验证siRNA的mRNA沉默效果。制备牛煅烧骨，将煅烧好的牛骨研磨成颗粒，过24目与50目筛，保留中间大小的颗粒。脂质体包裹好的siRNA与煅烧骨颗粒复合后冻干，与10%甘油明胶复合。将材料浸提后进行细胞毒性检测；将成骨细胞接种到材料上进行碱性磷酸酶检测、骨钙素及胶原的mRNA表达，并通过PCR实验检测Plekhol mRNA的表达以验证材料的mRNA沉默效果；制作大鼠颅骨缺损模型，植入上述复合材料，术后2、4、8、12w分别取材心、肝、脾、肺、肾、股骨、肌肉，进行HE染色，并取缺损部位进行HE染色及ALP、COL、OC的免疫组化染色；术后2、4、8、12w分别对大鼠缺损部位进行Micro-CT扫描。将复合材料植入裸鼠后肢肌间隙，术后8w取材，进行HE染色观察骨诱导情况。结果表明，siRNA复合材料在体内和体外均能发挥其有效性，促进成骨分化。