miR615-FBLN1信号通路对间充质干细胞牙向分化及再生的作用和机制研究

Elucidating the function and underlying mechanism of dentinogenic differentiation in mesenchymal stem cells is the key to improve the success of bio-root regeneration. miRNAs are found involving in cells differentiation. Our previous studies find that miR615-3p and the downstream gene FBLN1 may own the ability of regulating dentinogenic differentiation of mesenchymal stem cells. miR615-3p negatively regulates the FBLN1 by directly targets 3 'UTR of FBLN1. However, the detailed function and underlying mechanism of miR615-FBLN1 signaling pathway on mesenchymal stem cells mediated dentinogenesis and bio-root regeneration are still unclear. Based on the data, the loss/gain function studies are to investigate whether miR615-3p and FBLN1 participate in modulating the dentinogenic differentiate capacity of mesenchymal stem cells in vitro and in vivo. Moreover, informatics analysis, cell fractionation assay, RNA pull-down, RIP-qPCR, and luciferase assay are used to identify the circRNA binding to miR615-3p, and the interaction between miR615-3p and circRNA. Furthermore, informatics analysis, CHIRP, luciferase assay, and qRT-PCR are used to reveal the regulation mechanism of miR615-3p on FBLN1. This study will help us to discover the molecular regulation mechanism of miR615-FBLN1 signaling pathway in dentinogenic differentiation of mesenchymal stem cells, and provide theoretical basis and candidate target for bio-root regeneration.

阐明间充质干细胞牙向分化的功能和机制是提高生物牙根成功率的关键。miRNA在细胞分化过程中有着重要作用。课题组前期发现miR615-3p和下游基因FBLN1可能具有调控间充质干细胞牙向分化的能力；miR615-3p通过与FBLN1的3’UTR端结合负向调控FBLN1。但是miR615-FBLN1信号通路对间充质干细胞牙向分化和生物牙根再生的功能和调控机制不清。在此基础上，本课题拟利用获得性和丧失性功能研究阐明miR615-3p及FBLN1对间充质干细胞牙向分化的作用；通过生物信息学、RNA pull-down、RIP、生物素标记miRNA共沉淀等技术明确与miR615-3p结合的circRNA，及二者的相互作用；利用生物信息学、荧光素酶报告基因、CHIRP、qRT-PCR等方法揭示miR615-3p对FBLN1的表观遗传调控机制。本课题为促进生物牙根再生提供理论依据和候选靶点。

miRNA在表观遗传修饰中扮演着重要角色，对机体有着广泛的调控作用。miRNA在细胞分化有着重要作用。然而，miRNA在间充质干细胞牙向分化过程中的作用和分子调控机制仍不完全清楚。本研究利用获得性和丧失性功能研究阐明miR615-3p及FBLN1对间充质干细胞体内外牙向分化的作用及表观遗传调控机制。研究通过构建敲低miR615-3p细胞系，经成牙分化诱导，发现敲低miR615-3p显著增强ALP活性、ARS染色、转录因子OSX和成牙分化标志物DSPP、DMP1的表达，促进间充质干细胞牙向分化。而过表达miR615-3p具有抑制间充质干细胞牙向分化的作用。体内实验分别在裸鼠和新西兰白兔中进行，通过构建根管复合Matrigel基质-敲低miR615-3p间充质干细胞复合体进行裸鼠背部移植，构建新西兰白兔颌骨拔牙窝模型，将Matrigel基质-敲低miR615-3p间充质干细胞复合体进行拔牙窝移植，研究通过组织学观察前期牙本质样组织和成牙本质样组织的形成情况，免疫组化染色检测牙向分化标志物DSPP和DPM1的表达，电镜观察牙本质的超微结构，发现敲低miR615-3p组有较多的新的牙齿样结构形成，具有典型的牙周膜纤维包绕的牙本质样结构，牙本质结构中有规则排列的牙本质小管。进一步，本研究发现了miR615-3p的靶基因FBLN1具有增强间充质干细胞体内外牙向分化的作用。机制研究利用荧光素酶报告基因、PCR等实验揭示了miR615-3p通过与FBLN1的3’UTR端结合负向调控FBLN1。本研究发现了miR615-3p、FBLN1在不同组织来源的间充质干细胞牙向分化功能的共性调控作用，揭示了miR615-FBLN1信号通路调控间充质干细胞功能的分子机制，研究结果发现了miR615-3p在生物牙根再生中的重要作用，为促进生物牙根再生提供科学依据和候选靶点。