角蛋白17泛素化修饰在调节角质形成细胞银屑病表型中的作用及其机制研究

The cellular functions of ubiquitination span a wide spectrum that includes proteolytic and nonproteolytic roles such as proteasomal degradation of proteins; receptor internalization and downregulation; assembly of multiprotein complexes; intracellular trafficking;inflammatory signaling; autophagy; DNA repair and regulation of enzymatic activity. Thus, deregulation of ubiquitination has broad consequences.Psoriasis is a chronic inflammatory skin disease in clinic, of which pathogenesis is unclear. In prvious study, some ubiquitination related proteins or enzymes were up-regulated in psoriatic lesion and asscocited with the production of chemokines. However, the mechanism is still unknown. Our previous results showed that K17 is involved in the proliferation and activated immunocompetent of psoriatic keratinocytes. Meanwhile, the ubiquitination of K17 is upregulated in psoriasis. Therefore, we hypothesized that the ubiquitination of K17 may be involved in the regulation of immunocompetent of psoriatic keratinocytes. This study will identify the ubiquitiation position of K17 and find the specific E2/E3 and interaction proteins through Co-Immunoprecipitation and Mass spectrum. Next, constructing the mutation plasmids will inhibit the ubiquitiation of K17, and then variation of K17 function is observed. Finally, this study will confirm the function of ubiquitination of K17 in the pathogenesis of psoriasis, deepen the study on the modulation of K17, and provide new targets for the treatment of psoriasis.

泛素化修饰不仅参与蛋白质降解，还参与蛋白质相互作用、胞内信号转导、自噬和蛋白酶活性调节等，既是重要生理机制，也在炎症、肿瘤等病理过程中发挥作用。研究发现多种泛素化蛋白在银屑病皮损异常表达，并参与趋化因子分泌的调控，但其具体底物及作用机制尚不清楚。我们课题组前期研究发现角蛋白17（K17）的异常表达在调控银屑病角质形成细胞（KC）增殖及趋化因子分泌方面发挥重要作用。同时还发现，银屑病皮损处K17的泛素化水平明显增高，阻断其泛素化可有效抑制其功能，提示K17泛素化修饰可能参与其对KC免疫活性的调节。本课题拟在此基础上系统鉴定银屑病K17泛素化改变，并通过突变体抑制K17泛素化，观察其对K17功能活性影响，明确K17泛素化结合/连接酶及其相互作用蛋白，最终确认K17泛素化修饰在银屑病发生发展中的作用及其机制。研究结果将进一步揭示K17在银屑病发病机制中的作用，并为银屑病的治疗提供新的思路和靶点。

泛素化修饰不仅介导蛋白质的降解，还在蛋白-蛋白相互作用、DNA损伤修复、自噬及信号通路转导等多种生物学过程发挥重要的调控作用。在银屑病这一慢性炎症性疾病中，已有研究发现多种泛素化酶及去泛素化酶的单核苷酸多态性（SNP）和银屑病的发病相关。此外，这些泛素化酶能通过作用于不同的底物参与银屑病的发病。我们课题组前期研究发现角蛋白K17在银屑病表皮高表达，其异常表达在调控角质形成细胞过度增殖及炎症因子分泌等方面均发挥重要的作用。我们通过泛素化网站预测发现人K17上存在能被泛素化修饰的位点，提示泛素化修饰可能参与调控银屑病中K17的异常表达及角质形成细胞的功能。我们在体外首先用K17的免疫共沉淀实验，证实了在角质形成细胞中，K17能够受到泛素化修饰。结合质谱分析，我们检测得到了一组能够和K17作用的蛋白，并从中筛选得到了泛素化修饰K17的E3连接酶Trim21。我们在体外应用免疫共沉淀实验证实了Trim21能够结合并泛素化修饰K17。接下来，我们利用免疫荧光、免疫组化、Western Blot及RT-PCR等方法，检测到了Trim21在银屑病表皮呈现显著的高表达。进一步的机制研究发现在角质形成细胞中敲除Trim21，K17的蛋白稳定性下降；而过表达Trim21后K17的蛋白稳定性上调，提示Trim21可以增强角质形成细胞中K17的蛋白稳定性。结合免疫共沉淀实验，我们发现Trim21能够通过K63链连接泛素化修饰K17。Trim21泛素化K17后，增强了K17和STAT3的相互作用，进而促进STAT3通路的活化，促进角质形成细胞的增殖，加重银屑病的发生发展。本研究首次发现了泛素化修饰也是调控K17蛋白稳定性的一种重要方式并鉴定得到了泛素化修饰K17的E3连接酶。Trim21作为K17的特异性E3连接酶，可作为潜在的靶点为未来治疗银屑病提供新的方向。