组蛋白甲基化在心肌缺血损伤保护中的作用及其机制研究

Epigenetic regulation plays important role in tissue development and disease occurrence, development and prognosis. Recent studies including our previous work had shown that histone methyltransferase KMT2D regulated histone methylation (H3K4me1/2) could activate angiogenesis pathway in myocardial ischemic set (MI) and protect the MI injury. On the other hand, demethylase LSD1 was found to promote angiogenesis in various tumors. However, the true mechanism by which histone methylation participates the cardiopretection to MI is still unrevealed. To further determine how histone methylation contribute to the MI injury and the underlying mechanisms, we generate heart-specific gene knockout mice for Kmt2d and Lsd1 to determine the function of histone methylation on MI injury, and employ ChIP-seq to analyze the binding profiles of H3K4me1/2 and H3K27ac on the enhancers of the entire genome. Furthermore, we use in vitro system to confirm the Hif-Vegf regulated angiogenesis pathway by Base-editing the binding sites of HIF1a on the Vegf gene promoter in presence or absence of LSD1, whose loss results in higher level of histone methylation. Our research will uncover the role of histone methylation of enhancer region on the protection against MI injury and its mechanisms, focusing on the angiogenesis function in the protection. This study might shed light on cardio-protective function of epigenetic regulation in the ischemic condition, and lead to further findings for therapeutic targets of ischemic situation in the clinic in the future.

表观遗传调控在组织器官发育和疾病的发生、发展及预后的全过程中都发挥重要的作用。研究发现，KMT2D介导的H3K4的甲基化可能激活心肌缺血后血管新生通路从而对抗心肌缺血损伤；而去甲基化酶LSD1被报道具有促肿瘤血管新生的作用，但组蛋白甲基化参与心肌缺血损伤保护的具体机制并不清楚。为了进一步探究心肌缺血保护中组蛋白甲基化的作用，明确其机制，我们借助于基因敲除小鼠模型，在确定表型的基础上，用ChIP-seq对H3K4me1/2、H3K27ac在增强子的结合进行全基因分析，明确组蛋白甲基化在心肌缺血中的作用;为验证此作用并探讨其机理，利用Base editing进行体外实验，通过对Vegf基因启动子区域的突变，探索组蛋白甲基化在LSD1存在或缺失条件下血管新生中的作用及其机制。通过本研究，揭示增强子域的组蛋白甲基化在缺血心肌保护中的作用，进而为缺血心肌损伤的表观遗传学机制以及临床干预提供实验证据。

本课题围绕表观遗传机制中组蛋白甲基化修饰对心肌缺血损伤的保护作用展开，揭示了KMT2D介导的组蛋白甲基化修饰在缺血心肌保护中的作用机制。首先通过构建KMT2D心肌特异性敲除小鼠，探究KMT2D缺失对小鼠心肌缺血损伤的具体作用，明确了心肌细胞KMT2D缺失会导致小鼠心肌梗死面积增加，心肌细胞凋亡增加，血管新生受抑制，最终引起心脏功能恶化。与此同时LSD1抑制剂可逆转因KMT2D缺失所加剧的心肌损伤。其次，通过RNA-seq和ChIP-seq联合GWAS分析，筛选出KMT2D在心肌缺血中参与调控的潜在靶基因，明确了KMT2D通过调控基因增强子和启动子区组蛋白H3K4me1/H3K27ac修饰水平参与调控Rasd1基因转录。随后，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建KMT2D基因敲除H9C2细胞株，在此基础上，靶基因验证实验中明确Rasd1对体外低氧模型不敏感，其在心肌缺血中的差异表达可能与低血清导致的营养缺乏有关。进一步在KMT2D心肌特异性敲除小鼠心肌组织中发现血管新生受抑制，以及较低的VEGFA蛋白表达。为深入研究KMT2D跨空间发挥作用的具体机制，通过收集KMT2D敲除及野生型H9c2心肌细胞来源条件培养基处理血管内皮细胞以模拟二者间的旁分泌效应，基于此明确了心肌细胞KMT2D缺失通过降低Vegfa启动子区域H3K4me1修饰水平进而抑制Vegfa mRNA转录，最终阻碍了心肌细胞对内皮细胞的cross-talk效应以及内皮细胞功能，提示心肌细胞KMT2D可参与调控血管新生进而抵抗心肌缺血损伤。与此同时，组蛋白去甲基化酶LSD1可在KMT2D缺失时逆转心肌损伤，反向验证组蛋白甲基化修饰在心肌损伤中的保护作用。. 总之，本课题组深入探讨并揭示了表观遗传机制中组蛋白甲基化修饰在心肌缺血损伤中的作用及机制。明确了组蛋白甲基转移酶KMT2D介导的靶基因启动子和增强子区域的H3K4me1修饰，促进了靶基因Rasd1和Vegfa的转录激活，从而实现KMT2D在心肌缺血损伤中的保护功能。