玉米全基因组的超表达突变体生成系统的构建与特性研究

Overexpression mutant is generated by increasing the gene transcription to obtain special phenotype. In this project a verified plasmid is planned to transform maize embryogenic callus with large-scale by Agrobacterium-mediated transgenic technology. The plasmid contains a engineered transposon element that carries 35S enhancers. DNA sequence of T-DNA flanking from positive transformation event materials are compare with maize B73 genome and are be located on chromosomes. The core populations and high density populations of maize overexpression mutant generation lines with distribution covering the whole genome will be obtained. The basic biological characteristics of this system, such as artificial transposon chromosome location, frequency of transposition, jumping behavior, characteristics of insertion will be investigated completely. Using a dwarf dominant mutant and a yellow leaf recessive mutant as materials, the procedure of screening, identification, biological mechanism and reproduction of mutant traits are identified. The core population of overexpression mutant generation as launching platforms tag genes nearby to select beneficial morphological mutants with excellent agronomic traits, especially plant type and panicle traits, and to screen drought resistant mutants.

超表达突变体是通过提高目标基因转录水平从而使该基因的表达增强，可能产生特殊生物学表型的功能获得型突变体。本申请项目准备以玉米胚性愈伤组织为材料，利用农杆菌将已经构建成功并验证有效的激活标签突变体转化质粒，完成大规模的玉米转化过程，分离阳性转化事件材料的T-DNA侧翼序列，比较定位在玉米B73染色体上，获得均匀分布覆盖全基因组的玉米超表达突变体生成系核心群体和高密度群体。完成本超表达突变体生成系统的基本生物学特性研究，如突变源转座子染色体定位、转座频率、转座子跳跃规律、插入位置特征等。以前期发现并初步鉴定的株高显性突变体和黄叶隐性突变体为材料，完成和完善玉米超表达标签突变体筛选、鉴定、生物学机理研究、突变性状重现的实验流程。利用超表达标签突变体生成系核心群体作为跳跃发射平台，激活基因转录水平，筛选具有优良农艺性状的有益形态突变体特别是株型和穗部性状突变体，以及筛选抗旱突变体。

突变体的创造是玉米生物学理论研究和育种应用永恒的主题。超表达突变体又称为激活标签突变体，是通过提高目标基因RNA转录水平从而使该基因的表达增强，可能产生特殊生物学表型的突变体。本课题围绕构建玉米超表达突变体生成系统的目标，开展研究工作。主要结果如下.① 创制了玉米超表达突变体生成系群体。.利用自主设计并构建成功的超表达突变体转化质粒pHZM1-Rsc-activtion，进行了大量的农杆菌介导的转基因过程。分子鉴定转基因阳性植株，Southern杂交鉴定拷贝数，Tail-PCR获取人工转座子侧翼序列，生物信息学鉴定人工转座子在玉米染色体上整合位点。符合要求的阳性转化材料（Ds系）与携带有转座酶（Ac）的玉米杂交，总共获得68个独立的玉米超表达突变体生成系，分散在10条玉米染色体上。.② 研究了玉米突变体生成系的人工转座子的转座特性和诱变特性。.对玉米超表达突变体生成系的发生转座的后代，进行转座频率统计和插入位点分离测序，然后对序列进行生物信息学分析和染色体定位。发现人工转座子的转座频率从11.4%到90.1%，具有活跃的转座活性。人工转座子的迁移以同一染色体的同一臂为多，并且越临近起始点数量越多，有超过80%的转座是跃迁到另外的染色体。.③ 研究了35S转录增强子在玉米中的作用特性。.以前期筛选得到的两个超表达突变体为材料，分离得到增强子标签序列插入位点后，利用实时荧光定量PCR，分析两个突变体转座子插入位点附近基因表达情况。35S增强子在玉米染色体上作用范围距离可达60kb，一般不改变基因的组织表达模式，并且存在计量效应。.④ 完善了超表达突变体生成系的繁殖保种、筛选突变体和候选基因的分离程序。.⑤ 进行了玉米叶色黄化（yellow leaves,yl）突变体和株高矮化（Weaky）突变体的生物学研究。.本项目中获得的玉米超表达突变体生成系以及研究完善的突变体筛选、候选基因分离的方法，为将来在玉米中利用这套突变体生成系统，源源不断地创制各种超表达突表型变体材料，为玉米的基础生物学研究和玉米育种服务，打下了坚实的基础。