基于生物质谱的土壤铁还原菌膜蛋白质组学研究

Iron-reducing bacteria are an important class of ubiquitous microorganisms in soil environment. Iron-reducing bacteria drived iron reduction and coulped environmental effect is becoming a hot research field. The key scientific issue of microbial iron reduction is the extracellular electron transfer process, namely, how microorganisms extracellularly transfer electron to iron oxide in the soil.The spectral, electrochemical and gene techniques have revealed that out-membrane proteins are key components in the extracellular electron transfer process. However,the information of the structure, types, distribution and abundance changes of the proteins can not be obtained by these methods. Moreover, the dynamic changes of membrane proteins under environmental stress conditions can not be in depth explored. This project proposes the new idea to utilize proteomics technology based on biological mass spectrometry to deeply explore the electron transfer mechanism of iron-reducing bacteria on the protein level. The high resolution protein identification technology combined with high efficiency separation means will be utilized to in depth analyze the structural features of the key proteins, the existing forms and the activities of the proteins in the iron reduction process. The dynamic and integrated changes of iron reduction proteins will be panoramically studied under specific conditions. The driving mechanism of the dynamic changes of the key out-membrane proteins will be clarified, which will provide new clues to understand the electron transfer mechanism of iron-reducing bacteria in soil.

铁还原菌是土壤环境中普遍存在的一类重要微生物，其驱动的土壤铁还原转化及环境效应已成为热门领域。微生物铁还原的核心科学问题是胞外电子传递过程，即微生物如何将胞内电子传递至土壤氧化铁。光谱、电化学和基因技术揭示膜蛋白质是胞外电子传递过程的关键组分，但是这些技术不能深入解析膜蛋白质的结构，无法获取关键膜蛋白质种类、分布和丰度变化等信息。本项目利用基于生物质谱的蛋白质组学技术，在蛋白质水平上解析铁还原菌胞外电子转移机制。拟采用高分辨率的蛋白质鉴定技术，结合高效的蛋白质分离手段和酶解技术，深入解析关键膜蛋白质的结构特征，研究在铁还原活动过程中关键膜蛋白质的存在形式和活动规律，探讨不同电子供体/受体条件下铁还原菌关键膜蛋白质在量效方面的动态变化与铁还原能力的相关性，阐明关键膜蛋白质动态变化的驱动机制，为深入理解土壤铁还原电子传递机制提供新线索。

铁还原菌是土壤环境中普遍存在的一类重要微生物，其驱动的土壤铁还原转化及环境效应已成为热门领域。微生物铁还原的核心科学问题是胞外电子传递过程。 Shewanella oneidensis MR-1是研究胞外电子传递过程的模式菌株之一。MR-1的电子传递与细胞膜或周质间隙中的物质密切相关，但电子经内膜如何穿过周质到外膜仍不是很清楚，揭示膜结构中的物质在电子传递链中的作用，将是研究MR-1电子传递机制的重要突破点。本项目旨在利用生物质谱技术，克服光谱、电化学和基因技术在揭示膜蛋白质是胞外电子传递过程的关键组分时，不能深入解析膜蛋白质的结构，无法获取关键膜蛋白质种类、分布和丰度变化等信息的缺点。通过对“葡萄糖- MR-1-钙离子”体系建立高效膜蛋白提取和纯化方法并基于 SDS-PAGE凝胶电泳分离与LC-MS/MS技术对4个MR-1胶条膜蛋白质进行了分析，发现培养基中适当增加钙离子浓度可促进MR-1膜结构上分子量大约为37 kDa和20 kDa与胞外电子传递有关的膜蛋白质的表达；建立了基于SWATH定量质谱技术对MR-1膜蛋白质表达差异性的分析，对希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)铁还原菌在胞外电子传递过程中起关键作用的膜蛋白质进行结构，定量及比较分析。在好氧条件下，“葡萄糖- MR-1-水铁矿-钙离子”体系在MFC系统中具有最大输出功率和电流密度时，共有285种表达差异蛋白，其中显著上调的有185种，显著下调的有100种；结合质谱和拉曼光谱进行希瓦氏菌在胞外电子传递过程中起关键作用的膜蛋白质种类及细菌结构分布中的分析。利用铁还原菌希瓦氏菌表面关键膜蛋白区分希瓦氏和非铁还原菌（大肠杆菌等），确定了胞外电子传递的关键膜蛋白质及其在细菌分布空间位置；对好氧条件下“葡萄糖- MR-1-水铁矿-钙离子”体系下的不同钙离子浓度条件下的膜结构组成之一保外多糖进行了同步的研究，以此在研究膜蛋白的差异基础上，更深入揭示影响MR-1膜胞外电子传递影响的各个综合因素。本项目的完成为深入理解土壤铁还原电子传递机制提供了新线索，发表论文8篇，其中SCI论文4篇，培养2名硕士研究生，申请发明专利1件。