HFM1基因变异在卵巢早衰发病中的作用及致病机制研究

Premature ovarian failure (POF) is the hot spot in the field of gynecological and reproductive endocrinology research. The patients with POF have some diseases including osteoporosis, cardiovascular diseases, infertility, which affect the women's quality of life. The prevalence of familial forms of POF is approximately 12.7% of all cases, suggesting a strong genetic component to POF pathology. We have recently found a novel pathogenic gene of POF -- HFM1gene, encoding proteins (helicase) that regulate meiosis of oocyte. Moreover, the compound heterozygous mutation in HFM1 (c.2651T>G/p.Ile884Ser) occurs at a highly conserved sequence of SEC63 domain, while the c.2206G>A/p.Gly736Ser is predicted to affect protein function by comparison analysis. In this study, we propose to 1) screening and elucidate the HFM1 gene mutation in larger sample of women with POF, 2) detect the meiosis of oocyte from mouse by transferring the heterozygous mutant HFM1 gene constructed by CRISPR system, 3) examine the activity of HFM1 helicase using unwinding assay system, then demonstrate the relationship of HFM1 helicase and meiosis of oocyte. Our proposed research will reveal that the molecular mechanism of HFM1 gene variants involved in the pathogenesis of POF, and lead to new strategies to prevention and treatment of POF.

卵巢早衰（POF）是妇科内分泌领域的研究热点，其对女性生育力和健康可造成严重影响。POF发病有很强的遗传致病基础。我们研究发现一个新的POF致病基因—HFM1，其编码蛋白为一解旋酶，参与卵母细胞减数分裂；进一步生物信息学分析显示，HFM1杂合突变c.2651T>G/p.Ile884Ser 位于高度保守序列区，且c.2206G>A/p.Gly736Ser与蛋白功能有关，提示HFM1可能是通过影响解旋酶活性导致功能缺失而致病。本研究将扩大POF样本进一步筛查HFM1突变情况；在小鼠卵母细胞中导入HFM1杂合变异位点观察卵母细胞减数分裂；对体外表达的携带变异HFM1的解旋酶活性进行研究，进一步论证HFM1解旋酶与卵母细胞减数分裂的确切证据。本研究将有助于揭示HFM1变异导致POF发病的机制，为POF防治提供新的策略。

卵巢早衰（POF）是妇科内分泌领域的研究热点，其对女性生育力和健康可造成严重影响。POF发病有很强的遗传致病基础。HFM1是新发现的与POF的发生密切相关的基因，其编码蛋白为一解旋酶，参与卵母细胞减数分裂。本研究进一步扩大了POF人群进行HFM1突变情况的筛查；并构建小鼠卵巢特异性敲除HFM1基因进行功能研究，进一步论证HFM1解旋酶与卵母细胞减数分裂的确切证据。.通过对138例卵巢早衰（POF）患者与316例对照的HFM1基因进行测序分析，POF组中共发现了9处基因变异，涉及11例POF患者：其中新发突变5个位点，均为错义突变，另剪接突变1个及SNP位点3个。对照组中发现4个位点的SNPs，除3个在POF中出现的SNPs外，还有一个为p.Glu79Lys。POF组中发生HFM1基因变异的个体共11例（占7.97%，11/138例），其中发生基因突变的个体7例（突变率达5.07%，7/138例）；316例对照中发现4处基因变异，均为SNP位点，包括研究组中出现的3个SNPs及p.Glu79Lys，变异率为1.27%（4/316例），两组变异率与突变率比较均有统计学意义（P<0.01）。保守性分析显示，HFM 1蛋白第414位组氨酸（His）、第775位苯丙氨酸（Phe）及第1194位精氨酸（Arg）在生物进化过程中具有高度保守性，蛋白分析提示错义突变c.1241A> /p.His414Pro与c.3580C>T/p.Arg1194Cys对蛋白的功能影响较大。.同时，我们进行了HFM1基因突变的在体研究，基因分析发现，前期家系中存在的两个突变位点，在建模时风险很大，因此改为应用CRISP/Case9技术构建卵巢特异性敲除HFM1基因小鼠。通过载体构建、体外转录、Cas9/sgRNA的显微注射小鼠受精卵，获得F0代小鼠，F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，F1代杂合子与卵巢组织特异性Cre工具鼠交配得到F2代特异性卵巢敲除HFM1纯合子小鼠，进一步开展功能研究，包括其对原始卵泡池、卵泡发育、卵母细胞减数分裂及生育力等，探索HFM1在POF发生中的作用，为POF的发病机制提供新的理论依据与治疗靶标。