mTORC1 通过DNA甲基化调控胰岛β细胞的功能性成熟和分化

Normal beta cell maturation and differentiation state is an essential component of functional beta cell mass, and its defect will lead to onset of diabetes. Our published results have confirmed that mTORC1 plays an important role in beta cell function, apoptosis and proliferation. Interestingly, using our newly estabolished transgenic model, beta cell specific raptor knockout mice (ßRapKO), we observed immature beta cell phenotye, beta cell trans-differentiation and downregulation of DNA methyltransferases DNMT3a after mTORC1 ablation. Based on these observations, we hypothesized that “mTORC1 regulates pancreatic beta cell maturation and differentiation via DNA methylation”. The present study will use novel in vivo tracing system “β Cell specific EGFP expression Raptor knockout mice（ßRaptorKOGFP）”to clarify the effect of mTORC1 in different stages of beta cell maturation, perform microarray and Medip seq on puried GFP+ ß cells to identify core factors that are regulated by mTORC1-dependent DNA methylation, and carry out DNMT3a mechanism experiments in INS1 cells. We believe our study will provide a novel insight of treatment of diabetes.

成体β细胞的成熟分化状态是功能性β细胞容量重要组成部分，它的异常会导致糖尿病的发生。课题组已发表的研究证实，mTORC1在β细胞功能，凋亡及增殖中都起到重要的作用。课题组在β细胞选择性敲除mTORC1伴随蛋白Raptor的小鼠 (ßRapKO)中观察到β细胞的不成熟表型，及转分化现象，同时伴有甲基化转移酶DNMT3a表达下调和部分成熟相关基因甲基化的改变。本研究提出 “mTORC1 通过甲基化调控胰岛β细胞成熟分化”的假说，将使用创新的“β细胞EGFP特异表达的Raptor敲除小鼠”，在活体示踪下高效精准地观察mTORC1对β细胞成熟分化的影响，在GFP+β细胞上展开基因芯片和甲基化高通量测序，生物信息联合分析找到甲基化调控的关键因子，并在INS1细胞上深入探讨DNMT3a参与成熟分化的潜在机制。相信mTORC1/甲基化参与β细胞的成熟分化的机制研究，将为治疗糖尿病提供理论基础和研发思路。

2型糖尿病是由β细胞功能异常和外周胰岛素抵抗所共同引起的疾病。近年来发现胰岛β细胞成熟障碍以及去分化在2型糖尿病发病过程中起到重要作用，早期干预使去分化的β细胞重新分化成熟或者诱导胰腺其他内外分泌细胞向β细胞转分化从而增加功能性β细胞质量，对于2型糖尿病的治疗具有重要的指导意义。mTORC1 信号通路接受上游营养物质及生长因子等的信号，掌管细胞的生长代谢, 增龄。我们前期研究证实，mTORC1不仅调控β细胞质量，对β细胞功能性成熟也起到关键作用。我们观察到βRapKO小鼠胰岛内Dnmt3a蛋白表达的显著下调，提出科学假设：表观遗传修饰特别是DNA甲基化可能参与了由mTORC1介导的β细胞特异的不允许基因的上调和功能性成熟。为了验证Dnmt3a的中间介导作用，我们利用慢病毒在βRapKO小鼠胰岛过表达DNMT3A，分析过表达后胰岛转录组以及分泌功能变化。通过Microarray，MeDIP-seq，ATAC-seq和ChIP-seq多组学分析，探寻βRapKO小鼠表观遗传调控异常，并利用Western blot和免疫荧光进行验证。分选2周的WT和βRapKOGFP小鼠的β细胞进行Microarray，与之前的8周WT，βRapKOGFP和胰岛素泵治疗的βRapKOGFP小鼠转录组数据进行联合分析筛选mTORC1直接调控的基因，利用INS1细胞系通过PCR以及报告基因验证这些基因在β细胞向α细胞转分化过程中的作用。得出重要研究结果：1）β细胞在出生后早期，mTORC1信号通路高度激活，催化DNA甲基转移的酶DNMT3A在β细胞成熟过程中高表达。2）βRapKO小鼠胰岛转录和表观特性主要表现为不成熟基因的低甲基化而发生去抑制性表达上调。3）βRapKO小鼠胰岛过表达DNMT3A部分恢复βRapKO不成熟基因抑制作用和胰岛素分泌功能。4）βRapKO小鼠胰岛内α特异表达基因Etv1和Tspan12表达升高，通过INS1细胞系过表达验证发现这两个基因表达升高与胰高血糖素上调有关。对mTORC1/甲基化在细胞的成熟分化机制的研究，可以让我们找到合适的干预措施，促进胰岛细胞功能性成熟和GSIS，恢复功能性细胞容量，延缓和纠正糖尿病的进程。同时了解胰岛细胞分化状态的通路调控，也可诱导其他内外分泌细胞向成熟的β细胞转分化从而增加功能性β细胞容量，为糖尿病的治疗提供新的启示和思路。