基于磁性限进修饰的固定化金属离子亲和介质制备及其高效分离活性小分子肽的机理研究

Immobilized metal ion affinity technology was already successfully applied in separation and purification of recombinant peptides and recombinant protein with large molecules, but the isolation of bioactive oligopeptides from diluted complex biological mixtures still remains a significant challenge. Employing medium is a difficult task mainly due to the presence of concentrated proteins that can add undesired effects in the system such as blocking of adsorbent pores and competition for adsorption sites. The main objective of the project is surface modification of novel magnetic affinity carrier, such as silica and chitosan particles, with hydrophilic groups and metal ions. The effects of modified hydrophilic groups and metal ions sites on separation and purification efficiency for bioactive oligopeptides would be explored for allowing absorption of small peptides while diminish adsorption of large molecules. The particles as immobilized metal ion affinity medium (IMAN) will be evaluable as restricted access magnetic material (RAM) for the recovery of small bioactive peptides from synthetic biological systems. The thermodynamics of absorbent IMAN-RAM binding to peptides and its kinetics will be quantified with isothermal titration calorimetry (ITC) and spectrum method, so the combination mechanism of metal ion ligands with small molecules in bioactive peptides will be discussed. The binding force between ligands and bioactive oligopeptides will be quantified and controlled. The results would also provide a theoretical foundation and technical support for the efficient separation and purification of small bioactive peptides.

固定化金属离子亲和技术已经成功应用于重组多肽和重组蛋白质等大分子的分离纯化，但在应用于生物活性小分子分离富集时则效果不佳，主要是由于常规亲和介质表面更易吸附大分子蛋白，也易与目标小分子物质竞争配基吸附结合位点。本项目拟利用亲水性化合物、金属离子配基对典型无机、有机磁性亲和载体表面修饰，通过探索修饰化合物种类、亲和基团性能、金属离子配基种类等因素在分离过程中对减弱大分子干扰、强化活性小分子分离富集效果的影响，制备出对大分子具有限进作用的磁性限进固定化金属离子亲和介质(IMAN-RAM)。采用等温滴定量热和光谱技术对金属离子亲和介质与活性肽小分子的结合过程动力学和热力学特征进行研究，从分子水平揭示离子配基与活性肽小分子作用机理，量化IMAN-RAM配基和活性肽小分子结合之间的推动力，实现二者之间相互作用的调控，为开发快速高效分离富集系列活性生物小分子的新型分离技术提供理论基础和技术支持。

采用化学共沉淀制备了超顺磁性Fe3O4纳米粒子，采用包埋法和膜乳化原位复合法分别合成制备了磁性MSiO2、磁性MCS微球和磁性琼脂糖微球，优化制备工艺条件，确定了Cu2+为固定化金属离子磁性亲和介质的配基。制备了MSiO2@Cu2+ 、不同粒径规格的MCS @ Cu2+亲和介质，以乳源中的ACE抑制肽为活性小分子化合物模型，考察了上述IMAC亲和介质对活性小分子的亲和吸附效果，优化了IMAC亲和介质对活性小分子的亲和吸附条件以及重复使用性。.对上述磁性MSiO2、MCS微球表面分别进行聚乙二醇接枝修饰和二醇基化修饰，分别以不同分子量的MPEG为原料，制备了MSiO2@Cu2+@1000、MSiO2@Cu2+ @1900、MSiO2@Cu2+@5000、MCS@Cu2+@5000以及MCS@Cu2+@-OH等多种磁性限进固定化金属离子亲和介质（RAAM），优化了限进亲和介质制备的工艺条件，利用红外、热重和粒度分析仪等对限进介质进行形貌、结构和性能研究和表征。考察了不同分子量mPEG接枝的限进亲和介质在BSA大分子蛋白和小分子模拟混合体系中的应用，研究了不同分子量mPEG修饰后的RAAM在模拟体系中对BSA和实际酶解体系中对大分子蛋白的阻拒作用。.研究了MSiO2@Cu2+@5000限进亲和介质在酪蛋白酶解液中的应用，利用MSiO2@Cu2+@5000快速筛选出抑制活性较高的组分并纯化和表征了一个ACE抑制肽结构。.研究了MSiO2@Cu2+、三种不同粒径的MCS@Cu2+、MCS@Cu2+@5000和MCS@Cu2+@OH亲和介质对ACE抑制肽活性小分子的吸附机制。 .采用Zeta电位、UV、荧光光谱法以及微量热法研究了上述系列RAAM与BSA的相互作用及限进修饰分子mPEG阻拒BSA的作用机理，并提出了限进亲和介质阻拒大分子的作用机理假设。研究了IDA-Cu2+、IDA-Ni2+和IDA-Zn2+与BSA的结合作用机理，研究了ACE抑制肽GMKCAF与ACE的作用机理，分别测定RAAM与BSA以及ACE的结合热力学、动力学参数,以及IDA-Cu2+、IDA-Ni2+和IDA-Zn2+与BSA以及ACE的结合热力学参数,量化了磁性限进固定化亲和金属离子配基和活性肽小分子结合之间的推动力，为开发快速高效分离系列活性生物小分子的新型分离技术提供理论基础和技术支持。