构建上转换荧光纳米粒子标记的多肽芯片应用于蛋白酶活性检测和抑制剂筛选

In this project, upconverting nanoparticles labeled peptide microarray technology is used to develop a high-throughput assay format for protease activity and related inhibitors/substrates screening. Thrombin was chosen here as the model protease to establish this assay. The study will focus on three main points: (1) screening for thrombin substrates and inhibitors (2) studying the functional effect on thrombin in the presence of other vitamin K dependent proteases (e.g. Xa) (3) testing the thrombin activity/concentration in clinical samples (blood). This research will open up possibilities for the future to develop high-throughput analysis on protease/substrates and protease/inhibitors interaction. Ultimately, this new technology will also provide a new method for studying cellular signaling and inhibition, clinical testing and drug screening.

本项目将以上转换荧光纳米粒子标记的生物芯片为反应平台，凝血酶为主要研究对象，结合光学的检测手段，研发能够用于研究蛋白酶活性和相关抑制剂及底物筛选的高通量分析方法。探索和解决下述三个方面的问题：（1）凝血酶底物与抑制剂筛选；（2）其它维生素K依赖性蛋白酶（如Xa等）存在时对凝血酶功能的影响；（3）实际临床样品（血浆）中凝血酶活性/浓度的检测。上述研究为高通量分析蛋白酶与其底物、抑制剂间的相互作用提供了新方法，并为研究生命过程中相应信号传导与抑制、临床检测、药物筛选等提供了新技术。

本项目以上转换荧光纳米粒子标记的多肽芯片为反应平台，结合光学的检测手段，对凝血酶的活性,凝血酶与其底物和抑制剂间的相互作用以及其它蛋白酶（如凝血因子X）对凝血酶功能的影响进行了研究。以凝血酶为考察对象，建立了可以用于研究蛋白酶活性和相关抑制剂及底物筛选的高通量分析方法。具体研究内容包括：(1)合成并修饰了适用于标记多肽芯片的上转换荧光纳米粒子标记物，对其结构和性质进行了表征；(2)通过在其他干扰蛋白酶（如凝血因子X）存在的条件下筛选出合适的凝血酶底物，建立了适用于凝血酶检测的多肽芯片平台；(3)使用上转换荧光纳米粒子对已经建立的多肽芯片进行标记，对凝血酶的活性和凝血酶抑制剂的抑制效率进行了考察，用该方法得到了凝血酶的标准工作曲线和米氏常数(Km)值，并得到了和文献报道相符的抑制剂IC50值；(4) 使用上转换荧光纳米粒子标记的多肽芯片对实际临床样品(血清和血浆)中凝血酶活性以及抑制剂的抑制效率进行了研究，并分析了该方法在实际样品检测中的应用价值。该项研究为高灵敏度、高通量分析蛋白酶与其底物、抑制剂间的相互作用提供了新方法，并对疾病的诊断、治疗和机理的研究及相关药物的筛选都具有重要的意义。