ClpP基因在变异链球菌对外应激耐受中的表达变化及调控机制的研究

Clp蛋白酶参与调节生物体蛋白质代谢过程，在清除不可逆损伤蛋白质、对外应激耐受及维持内环境稳态等生物过程中发挥重要作用。然而Clp蛋白酶在变异链球菌中的生物学功能及其催化亚基ClpP的基因表达调控机制至今尚未被完全阐明。为此，本课题拟研究热休克、氧化应激、低营养状态等因素对变异链球菌ClpP基因表达的影响，并初步探讨ClpP基因在对外应激耐受中对变异链球菌生物学性状的影响；继而利用Gus报告基因表达系统研究外界生长条件变化诱导或沉默ClpP基因表达的机制，随机重组筛选参与ClpP基因表达调控的基因，并用EMSA验证该基因表达产物与ClpP基因启动子的相互作用，为阐明ClpP基因在变异链球菌中的生物学功能提供试验依据，并为将来研制以ClpP为靶点的抗菌药物奠定理论和实验基础。

变异链球菌在牙表面黏附和聚集并进一步形成牙菌斑是其致龋的前提，然而在口腔中定植并生存的微环境极易受到人类日常活动的影响，呼吸、言语、进食等动作可使口腔的酸碱度、温度、氧分压、渗透压等在一定范围内波动。在应激环境下，损伤及错误折叠的蛋白质积聚增加，这些损伤的蛋白质不但不能在细菌中执行生物学功能，还会对细菌造成致死性损伤。因此，变异链球菌感受环境刺激和清除成为损伤及错误折叠蛋白质的能力是其成为龋损部位的优势菌以及致病非常重要。研究表明，变异链球菌可通过蛋白质水解作用、双元信号传导系统及密度感应系统等调节细胞代谢来对抗环境的剧烈变化，以维持内环境的稳定，其中最为重要的是ClpP介导的蛋白质水解作用。研究证实ClpP不仅参与监视内环境中蛋白质的稳定，还参与DNA损伤修复、维持细胞结构等其他重要生物学功能。.本研究的目的是深入探讨ClpP基因在变异链球菌对外应激中的作用及其机制。取的主要的实验结果如下：.(1)变异链球菌ClpP基因在热休克、氧化应激、低pH值状态下表达增强，而在低营养培养基CDM中表达降低；.(2)ClpP基因缺失突变株在热休克、氧化应激、低pH值及低营养状态生长缓慢，但是具有较野生株更强的抵御致死pH值环境的能力，在致死pH值环境细菌自溶率较野生株低；.(3)ClpP基因缺失突变株在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中成膜能力增强，而在葡萄糖作为唯一碳源的培养基中成膜能力减弱；.(4)ClpP基因缺失突变株在不同碳源培养基中成膜能力的变化时通过增强或减弱在牙表面黏附和聚集能力实现的；.(5)ClpP基因缺失突变株产生杆菌肽的能力较野生株显著下降；.(6)在变异链球菌UA159株中ClpP基因存在1.9kb和0.67kb两种转录产物，其中0.67kb转录产物的含量占总表达产物的80%，而1.9kb转录产物占20%，两者在菌体半衰期均小于1min；.(7)变异链球菌UA159株ClpP基因5’-侧翼序列时发现一串联重复序列，位于转录起始位点上游192bp处。在热休克、氧化应激、低pH值状态下变异链球菌可以通过该串联重复序列上调ClpP基因的表达；.(8)CtsR可以负调控变异链球菌UA159株ClpP基因的表达；.(9)Microarray结果显示许多应激相关基因和TCS在ClpP基因缺失突变株表达增强。