基于定向蛋白质组学的肠毒素快速分型鉴定和定量确证研究

In recent years, enterotoxins have often been found in food poisoning incidents. Low content of enterotoxins could cause people poisoning. It is difficult to detect them in food contamination. It has become the global forefront topic in public health research. Existing methods can only detect the bacteria itself or its enterotoxin coding genes, but they can not directly confirm whether enterotoxins had been produced. Thus, it may cause the potential risk for food safety. A method based on targeted proteomics strategy and mass spectrometry is developed for fast typing and quantitative confirmation of Staphylococcal enterotoxins in the project. This method is of high specificity and sensitivity, good repeatability and accuracy. It can be applied for food safety monitoring, early risk warning and enterotoxin-related diseases diagnosis. The characteristic peptide spectrum, specific peptide fragment ions and fracture mechanism of target enterotoxins in food matrices can be acquired using mass spectrometry of high-throughput and high selectivity. Artificial peptides containing isotope labels are designed and synthesized as internal standard to spike into samples for improving accuracy and reliability of enterotoxin determination in complex food samples. Research results can be used to prevent and diagnosis enterotoxin-caused food poisoning, ensure food safety and reduce the incidence of infection and food poisoning outbreak.

肠毒素在近年来的食物中毒事件中检出率高，且在污染食品中含量低，难被检测，成为全球性的公共卫生研究热点问题。现有的方法只能检测到细菌本身或其肠毒素编码基因的存在，无法直接确证是否产生了肠毒素，导致食品安全存在潜在的风险。本项目针对食品监测、风险预警和相关疾病诊断中肠毒素检测的快速性、高特异性、高灵敏度、可重复性、多种肠毒素同时准确定量并同时分型检测等要求，研究了基于质谱-定向蛋白质组学策略的肠毒素快速分型和定量确证检测方法。利用质谱的高通量和高选择性定向搜集目标物中不同血清型肠毒素的特定肽段离子，研究肠毒素的特征肽谱及其断裂机理，改善和提高检测灵敏度。设计合成含有同位素标记的肽段作为内参，加入待测样品中进行处理分析，以提高复杂样品中肠毒素定量检测的可信度和准确度。研究成果可用于预防和诊断由肠毒素引起的食物中毒，保障食品卫生安全，减少人感染和中毒事件的发生，对我国食品安全监测有重大意义。

近年来食物中毒事件中的金葡球菌肠毒素检出率较高，但在污染食品中含量低，难被检测，成为全球性的公共卫生研究热点问题。现有的方法只能检测到细菌本身或其肠毒素编码基因的存在，无法直接确证是否产生了肠毒素，导致存在潜在的风险。因此，急需建立准确快速的分型识别鉴定和定量测定技术。本研究基于定向蛋白质组学和液相色谱-串联质谱技术，建立了不同血清型肠毒素的快速分型识别鉴定和定量测定技术。从理论模拟和实验验证两个层面开展了肠毒素特征标记肽的筛选。理论模拟研究主要借助生物信息软件工具，对数据库中的肠毒素进行分析和信息挖掘。实验验证研究主要是将肠毒素蛋白标准品用胰蛋白酶进行酶切后，注入LC-MS/MS仪器进行分析，然后通过相关软件进行处理分析。最终为每种血清型肠毒素分别选择了两条特异性高、响应信号强的特征标记肽。通过化学合成法人工合成了这些特征标记肽，同时引入稳定同位素标记氨基酸合成了对应的内标物。然后以这些合成肽作为标准品，优化了其多反应监测的最优色谱质谱条件，从而建立了基于特征标记肽的MRM-LC-MS/MS技术，用于对不同血清学肠毒素进行快速分型识别鉴定和准确定量测定。经过优化样品前处理方法后，将建立的分型识别鉴定和定量测定技术用于分析样品中的肠毒素，为相关食品中肠毒素污染的潜在风险预警和有效监管提供有力的技术支撑。