一种基于TGA/TGH共修饰酸度敏感型肿瘤双靶向纳米探针的研制与宫颈癌早期诊断研究

Quantum dots (QDs) have excellent optical characteristics, but they are easy to be adsorbed or swallowed by cells because of their nano-particle size and so many surface charges. So, they can not achieve the specific recognition of normal and tumor cells. Changing their surface properties or increasing specific groups is one of effective strategies. In my preliminary study, QDs connected PEG through acidity-sensitive hydrazone bond can identify some particular acidity. Based on the special environment of tumor cells, this project intends to start with preparation pH-sensitive TGA/TGH modified QDs, and then links the tumor markers of cervical cancer to QDs, to build the dual targeting nano-probe. Used on cultured cells and animal models, this nano-probe would achieve early diagnosis and accurate localization of cevival cancer on the cellular and molecular levels. This study expects to complete the preparation of pH sensitive nano-probes. This probe would identify tumor cells from normal cells and achieve early and specific diagnosis of cervical cancer cells. Furthermore, it would achieve the early diagnosis, fluorescence imaging and and tracing of cervical cancer in vivo of animal models. This work will not only give a new dual targeting and intelligent method for the early diagnosis of cervical cancer, but also provide a new idea for nano-probes' applications in early diagnosis of cancers.

纳米量子点具有优良的光谱性质，但其纳米粒径和丰富的表面电荷决定了它在细胞表面的强烈吸附和被细胞吞噬的可能，因而量子点未修饰前无法完成对正常细胞和肿瘤细胞的特异性识别。改善表面性质、增加特异性基团是实现量子点对肿瘤细胞定向识别的有效策略。申请者前期研究发现，利用酸度敏感的酰腙键作为PEG与量子点的连接键，可实现量子点对于特定酸度环境的识别。基于肿瘤细胞周围环境的特殊性，本项目拟以制备TGA/TGH共修饰的酸度敏感型纳米量子点为切入点，将宫颈癌肿瘤标志物与其相链接，构建酸度敏感/肿瘤标志物双靶向纳米探针；应用于培养细胞和动物模型，在细胞和分子水平研究，实现对宫颈癌的早期诊断。预期结果:实现酸度敏感型纳米探针的构建；完成对肿瘤细胞的特异性识别；通过动物模型实现在体宫颈癌的早期诊断、荧光成像及准确定位。本课题将为宫颈癌早期诊断提供双靶向、智能化的检测新方法，也为纳米探针用于肿瘤早期诊断提供新思路。

本研究以巯基乙酸（TGA）和巯基乙酰肼（TGH）为稳定剂，聚乙二醇（PEG）为表面修饰剂，采用水相回流法和水热合成法制备酸度敏感型CdTe量子点（PEG-TGA/TGH-CdTe QDs），该纳米探针的荧光发射波长位于510~620 nm，荧光效率达21%。经透射电镜、X-射线衍射及粒度分析，制备的PEG-TGA/TGH-CdTe QDs的平均粒径为39.9 nm，为立方晶型结构，尺寸分布均匀。.在体内及体外两个层次考察酸度敏感型纳米探针的生物安全性。采用MTT法对不同稳定剂修饰的CdTe QDs对宫颈癌细胞（HeLa）存活率的影响，评价不同CdTe QDs对HeLa细胞的毒性作用，表明PEG-TGA/TGH-CdTe QDs由于链接长链PEG可以有效降低量子点的细胞毒性，45µg/mL高剂量组染毒24h后细胞存活率仍高达84%。以昆明小鼠为实验动物，采用单次尾静脉注射的方法，观察7天内TGA/TGH-CdTe QDs和PEG-TGA/TGH-CdTe QDs对于小鼠的体内毒性作用。单次尾静脉注射TGA/TGH-CdTe QDs10.0mg/(kg.bw)后，小鼠出现死亡，体重显著降低，肝脏系数明显升高，肝、肾脏病理学观察发现明显损伤，肝脏及肾脏镉离子蓄积明显，血生化检测发现白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT/GPT）、血肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）等与肝、肾脏器损伤有关的指标有显著变化，脏器氧化应激分析也发现肝、肾氧自由基产生过量，抗氧化酶活性降低，表现出明显毒性。而经PEG修饰后，PEG-TGA/TGH-CdTeQDs经以上各指标的考察，其体内毒性表现不明显。.巯基乙酰肼（TGH）与PEG醛发生反应后，生成的腙键在生理条件下结构稳定，但在酸性环境下，聚合物和纳米量子点之间的腙键断裂可以将量子点释放出来。本研究考察了PEG-TGA/TGH-CdTe QDs在不同pH条件下的光学性质，通过比较不同pH环境中量子点对于细胞的标记情况，研究量子点对HeLa细胞酸性微环境的识别能力。以TGA/TGH-CdTe QDs为基础，同时链接mPEG醛和Ab制备出的PEG-TGA/TGH-Ab-CdTe QDs，可以实现对肿瘤细胞的特异性标记。本课题的生物安全性评价为量子点进一步的深入研究提供依据，制备的双靶向纳米探针在体内肿瘤成像方面也具有广阔的应用前景。