山茶属植物45S rRNA 假基因的结构、功能与进化研究

The 45S rDNA repeats are essential housekeeping genes found in all eukaryotic organisms, their structure and particular evolutionary patter have been widely and well known, and some fragments of them have been utilized by many systematic botanists as the molecular makers to reconstruct the phylogenies of many taxa. However, in our previous works, we found many 45S rRNA pseudogenes in the genome of Camellia species, and these pseudogenes have over 1000 copies and a remarkably long evolutionary history and some of them may be transcribed. These findings are contradictory to our present understanding of rDNA evolution and also can not be explained by hybridization and polyploidization. Thus, we have proposed a hypothesis: rRNA pseudogenes have a new unknown function and a particular evolutionary pattern. In this project, we will select three camellia species with different ploids (2x, 4x, 6x) as materials to identify their 45S rDNA loci using the FISH, to amplify biasedly some fragments of 45S rDNA pseudogenes, and to sequence these fragments using the Miseq Platform. Also we will test which of the pseudogenes can transcribe using the RNA-seq and which of rRNA from the pseudogenes can interact with proteins by the CLIP-Miseq. The aim is to test whether rRNA pseudogenes have a new function and to reveal the evolutionary dynamics of the 45S rDNA pseudoenges in Camellia species, which will improve the understanding of the role of rDNA in living organisms.

45S rRNA基因是真核生物最重要的管家基因之一，拷贝间被认为通过一致进化保持高度一致，它的一些片段作为分子标记被系统学家广泛应用。然而，申请者前期研究发现众多山茶属植物的基因组内存在大量45S rRNA假基因，其拷贝是如此之多、起源又十分古老且还可能转录，这与现有的进化理论相矛盾也不能用杂交和多倍化来解释，推测这些假基因可能有新功能和进化模式，但有待验证。本项目以不同倍性的3个山茶属植物为材料，用原位杂交确定45SrRNA基因的位点，用高通量测序平台测定这些假基因的片段和检测假基因的转录水平，并用RNA-蛋白质互作平台检测rRNA假基因产物可能的结合蛋白；整合rRNA基因的序列数据集、空间结构信息及转录式样，确定45S rRNA假基因是否具有功能，揭示其在山茶属植物基因组内的多态性、进化样式及动力，从而更深入地认识rDNA在生命活动中的功能及基本生命活动过程。

rDNA基因家族是真核细胞里最古老、拷贝数最多、转录量最大的基因家族，每一个细胞里拥有数十至数万不等的拷贝，以串联重复的方式成簇分布于1至数个位点上。rDNA的进化令人迷惑不解，基因组里的同一种rDNA重复单元几乎所有拷贝都保持一致或高度相似。一致性进化（concerted evolution）是目前解释这一现象的标准模型。本项目将宏基因组方法改进、推广至检测山茶属植物个体内rDNA的多态性，发现山茶属植物的26S rDNA存在广泛而高度的多态性，其多态性主要源于基因组内存在大量的rDNA假基因，这些假基因在不同进化历史时期从功能基因退化而来，有许多假基因从山茶属植物起源的早期就产生，在随后的进化不仅未被删除，而且有一些还多次扩增其拷贝。通过分析不同年龄的假基因发现它们有固定的进化方向，都朝着降低自由能的方向进化，G/C逐步被A/T替代，前者含量从61%下降至~47%，缺失增加而成为碎片，据此提出了山茶属植物rDNA进化的混合模型——兼有一致性进化与生死进化（birth and death evolution）。本项目还构建了一个包括3个物种2个杂交后代（F1）的山茶属植物的远缘杂交体系，用以检测杂交及亲本的遗传分化对rDNA及其它基因转录的影响，发现一些rDNA假基因，包括一些十分古老的假基因依然能够进行转录，但转录丰度与假基因与功能基因间的遗传差异呈显著的负相关。同时发现杂交也能显著地激发F1中转座子的活性，并使约一半（51.7%~57.8%）基因改变了表达，且发现改变模式受亲本遗传分化水平的影响，亲本的遗传分化越大非加性的差异表达基因也越多，受顺式调控分化影响的基因比例增加而受反式调控分化影响的基因比例则下降。. 本项目构建的实验体系可以推广至研究其他物种的rDNA以及基因组内的其它重复系列的进化，构建的实验材料可以用于深入探讨杂交过程以及杂交过程中亲本遗传分化程度对rDNA及所有基因转录的影响，获得的山茶rDNA假基因可视为基因组内的活化石，进一步深入研究rDNA进化之谜。