艰难梭菌不同毒株黏附关键基因多态性对Caco-2细胞黏附能力的影响

Clostridium difficile caused severe healthcare-associated infection（HAI）. C. difficile were pathogenic to humans , adhesion and invasion is also crucial in addition to the toxins associated with the human intestinal cell. We had discovered the novel hypertoxigenic C. Difficile,but the polymorphism of key adhesion-related gene associated with the strain of C.difficile adhered to Caco-2 cells remains unknown. To further investigate the adhesion of C. difficile key adhesion-related gene polymorphisms and expression of adhesion differences on human intestinal cell. We intends to analyze the polymorphisms and related evolution of C. difficile adhesion-related gene. To determine the relevance between different types of C.difficile and adhesion-related gene polymorphisms. On this basis, to isolate the surface of the protein of C.difficile, and identify the adhesion protein by mass spectrometry kind. Finally, by using c.difficile-cell adhension tests and Leica microsystems techniques to determine different polymorphisms of C.difficile with differences adhesion to Caco-2 cell. In vitro confirmed the adhesion of C. difficile adhesion-related gene polymorphisms and expression of adhesion differences on human intestinal cell. This project will not only provide a new hot spot for the study of C. difficile pathogenicity, but also provide a research base for the development of vaccine for prevention and treatment of C.difficile infection.

艰难梭菌可导致严重的医院感染。艰难梭菌对人体的致病性，除与毒素相关外，对肠道细胞的黏附侵袭也至关重要。申请者前期研究发现了新型艰难梭菌高毒株，但其黏附基因特征及黏附能力尚不明确。为深入探讨新型艰难梭菌高毒株与普通流行株黏附基因多态性及对人体肠道细胞的黏附能力差异。本项目首先对不同症状患者来源和不同毒力的艰难梭菌黏附关键基因，进行生物信息学分析，明确新型高毒株及不同毒力株黏附关键基因差异性；在此基础上，提取艰难梭菌表面黏附蛋白，并对黏附蛋白的种类和表达量进行分析；最后通过艰难梭菌-细胞黏附实验及共聚焦荧光显微镜分析，明确艰难梭菌对Caco-2细胞的黏附性差异。体外证实新型艰难梭菌高毒株及不同来源、毒力的艰难梭菌黏附关键基因差异，导致对人体肠道细胞具有不同的黏附性，以及差异的关联性。本项目可为艰难梭菌对宿主致病机制提供新的研究热点，并可为研发预防艰难梭菌感染疫苗提供研究基础。

艰难梭菌可导致严重的医院感染，特别是高毒株致死性高。艰难梭菌对人体的致病性，除与毒素相关外，对肠道细胞的黏附侵袭也至关重要，这与其非毒力致病因子相关。本研究深入探讨不同毒素类型艰难梭菌，非毒力致病因子的特点与毒力相关性，以及与黏附基因多态性及对人体肠道细胞的黏附能力差异。本项目主要研究内容包括对不同症状患者来源和不同毒力的艰难梭菌黏附关键基因Slpa，进行生物信息学分析，明确不同毒力株黏附关键基因差异性；在此基础上，对艰难梭菌非毒力致病因子的表型进行分析，包括芽孢产生及萌发能力、鞭毛与游动能力、生物膜形成等；最后通过小鼠实验体外证实艰难梭菌高毒株及不同来源、毒力的艰难梭菌，其毒力强弱与非毒素致病因子的关系。本研究结果发现：1、艰难梭菌全基因测序，对Slpa基因进行了分析，发现不同毒力株的Slpa基因差异较大，未呈现明显的毒力与Slpa基因特点的关联性。2、部分毒素A-B+ ST37（1346）菌株毒素B高表达，其毒素B的产生量甚至高于027高毒株R20291和UK6，对CT26细胞毒性与R20291相当，高于CD630，但小鼠致死性实验显示毒力尚低于R20291和UK6（2017年在美国完成）。3、新型A+B+CDT+ ST201菌株呈现出高度芽孢形成能力及萌发能力；且其游动性高于CD630及A+B+ ST54临床株，电镜照片显示其周鞭毛较CD630及A+B+ ST54临床株丰富；其生物膜形成能力与027高毒株R20291相当，高于CD630及ST54临床株；但小鼠致死能力低于R20291，高于CD630和ST54临床株（2017年在美国完成）。4、高产毒素株A-B+ ST37（1346）未显示出明显的非毒力致病因子特点，但A+B+CDT+ ST201（LC693）显示出明显的非毒力致病因子特点，可能有助于其对人体肠道细胞的黏附和侵袭。本项目研究结果可为艰难梭菌对宿主致病机制提供新的研究热点，并可为研发预防艰难梭菌感染疫苗提供研究基础。