CSN6介导垂体ACTH细胞中糖皮质激素非基因组作用的分子机制

The non-genomic action of glucocorticoids plays an important role in physiological and pathological processes. Our previous data showed that the rapid inhibitory effect of glucocorticoids on pituitary adreno-cortico-tropic-hormone (ACTH) secretion was a non-genomic action mediated by membrane glucocorticoid receptor (mGR), but the molecular mechanism was still unclear. In the present study, we will employ co-immunoprecipitation and mass spectrometry to screen and identify the key membrane protein profiling mediating the fast action. We will also use bio-informatics analysis, Western blot and immunefluorescence to identify and verify the candidate protein CSN6 (Constitutive photomorphogenesis 9 signalosome subunit 6). Then, we will knockdown CSN6 by shRNA transfection, and the GR trafficking in the cells transfected with CSN6 shRNA. To explore the mechanism that regulating the non-genomic action of glucocorticoids by CSN6, we will use protein phosphorylation arrays to set up a phosphorylated protein profiling. We will check the fold change of protein phosphorylation level, after CSN6 was knock down. And we will also conduct experiments to check the inhibitory effect of the phosphorylation signaling pathway on GR trafficking. Finally, we will apply the pituitary cell perifusion system to verify the relationship between the candidate proteins as well as the phosphorylation signaling pathway with the rapid inhibitory effects of glucocorticoids on pituitary ACTH secretion. The implementation of this project will have a critical academic significance on clarifying the non-genomic action of glucocorticoids, and then provide the theoretical basis for clinical treatment of Cushing syndrome.

糖皮质激素（GC）的非基因组作用在机体生理和病理过程中具有重要的生物学意义。我们前期研究发现，GC与垂体ACTH细胞的细胞膜GR结合，快速抑制垂体细胞ACTH的分泌，属于非基因组作用，但其分子机制尚不明了。本项目（1）采用co-IP和质谱技术，确定介导GC非基因组作用的细胞膜蛋白谱，采用生物信息学方法、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光等技术，确定并验证候选蛋白CSN6；敲减CSN6，检测其对GR转运的影响；（2）采用磷酸化抗体芯片，确定调控GC非基因组作用的磷酸化信号通路；敲减CSN6，检测蛋白磷酸化水平的变化；抑制磷酸化信号通路对GR转运的影响；（3）采用大鼠垂体细胞灌注系统，验证CSN6和磷酸化信号通路与GC对ACTH分泌快速抑制作用的相关性。本项目的实施，对阐明GC非基因组作用的分子机制具有重要的学术意义，也将为皮质醇增多症等综合征的临床治疗提供理论基础。

糖皮质激素的非基因组作用在机体生理和病理过程中具有重要的生物学意义。我们前期研究发现，糖皮质激素与垂体ACTH细胞的细胞膜GR结合，快速抑制垂体细胞ACTH的分泌，属于非基因组作用，但其分子机制尚不明了。AtT20细胞膜蛋白的co-IP样本银染发现对照组和皮质酮处理组存在差异蛋白条带。质谱分析检测到34个差异表达蛋白。生物信息学分析确定了9个候选蛋白。CSN6可能与GR形成复合体，参与受体转运。敲减CSN6，皮质酮刺激后GR的细胞内转运显著抑制。蛋白免疫印迹实验结果显示皮质酮刺激引起激酶Akt（Ser473）、Erk（Thr202/Tyr204）和Mek（Ser217/221）位点快速磷酸化，随后又恢复至正常水平。敲减候选蛋白CSN6显著抑制Akt、Erk 及Mek 激酶磷酸化。抑制激酶磷酸化阻止了GR在细胞内的转运。我们采用磷酸化抗体芯片和磷酸化组学测序，解析CSN6调控糖皮质激素非基因组作用的磷酸化信号通路，验证了信号通路的上下游蛋白。同时，我们在大鼠垂体细胞灌注系统中验证CSN6和磷酸化蛋白对皮质酮快速抑制垂体细胞ACTH分泌的作用。项目建立大鼠垂体细胞的体外培养方法，并建立了大鼠垂体细胞的灌注体系，能模拟垂体在体外的生理环境。项目完成了调控糖皮质激素非基因组作用的功能蛋白的筛选工作，鉴定了9个候选蛋白，并在AtT20细胞和垂体细胞灌注系统内验证功能蛋白对糖皮质激素快速反馈的作用。候选蛋白CSN6通过激活Mek/Erk和Akt磷酸化信号介导GR受体转运，调控糖皮质激素的快速反馈。Pyk2磷酸化可通过抑制GR向细胞核转运，介导糖皮质激素的反馈。本项目分析了高浓度的糖皮质激素对GR在细胞内分布的影响，以及在激素刺激下受体转运的变化，进一步阐明高浓度的糖皮质激素的残留影响糖皮质激素反馈的分子机制。垂体中糖皮质激素反馈的敏感性取决于皮质酮给药前细胞所处环境的激素浓度。本项目对阐明糖皮质激素非基因组作用的分子机制具有重要的学术意义，也将为皮质醇增多症等综合征的临床治疗提供理论基础。.