奶牛乳腺炎中microRNA的表达分析和靶标基因的功能研究

Bovine mastitis is one of the most important diseases that seriously hamper the healthy development of China's dairy industry. It is well known that miRNAs are involved in cell differentiation, cell growth and diseases. However, the role of miRNAs in the inflammation process and host defense mechanisms is not very clear. In this study, dairy cows will be experimently infected with two most important mastitis-inducing bacteria: Staphylococcus aureus and Escherichia coli. miRNA libraries will be constructed from milk-derived microvesicles and mammary gland tissues taken from the infected dairy cows as well as non-infected controls and will be sequenced by the Solexa sequencing method. The sequencing data will be bioinformatically analyzed to detect differentially expressed miRNAs during S. aureus and E. coli infections. The correlation between milk-derived microvesicle microRNAs and mammary tissue miRNAs will be explored. The target genes of selected miRNAs will be identified and validated. The effect of the target genes on the expression of down-stream signals in the inflammation signalling pathways will be investigated in order to further understand the role of miRNAs in bovine mastitis. It is hoped that the bovine miRNAs database will be enriched by discoving novel miRNAs from this research. Certain milk-derived microvesicle miRNAs could be used as potential diagnostic biomarkers for different types of mastitis. A variety of protein expression during the inflammation might be manipulated by inhibiting or mimicking certain miRNAs, leading to an innovative approach to effectively prevent and control mastitis. Finally, the results from this research may lay a foundation for potential breeding of disease resistant dairy cows in the future.

奶牛乳腺炎是严重制约我国奶牛业健康发展的重要疾病之一。miRNA在细胞分化、生物发育及疾病中发挥巨大作用, 但在奶牛乳腺炎宿主免疫反应和炎症反应中的作用研究有限。本研究拟以金黄色葡萄球菌/大肠杆菌感染的奶牛乳腺炎模型为研究对象，首先利用Solexa方法分别对金黄色葡萄球菌感染、大肠杆菌感染以及健康奶牛的乳腺组织和乳汁微泡的miRNA进行高通量测序，揭示不同乳腺炎差异表达的miRNA, 探索乳腺组织miRNA和乳汁微泡miRNA之间的相关性, 预测和验证其靶标基因，通过对候选靶标基因在炎症通路下游的信号分子的影响来研究miRNA在奶牛乳腺炎中的调控作用及机制。本研究可进一步丰富奶牛miRNAs数据库，在乳汁微泡miRNA中有可能寻找到诊断奶牛乳腺炎的生物标记物，也可通过抑制或模拟相关的miRNAs来调节炎症中蛋白质的表达，从而发展出一套新的奶牛乳腺炎防治方法, 并为今后抗病育种提供理论依据。

金黄色葡萄球菌是引发奶牛乳房炎最主要的病原菌之一，可长期定植于乳房组织，感染率很高，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失，然而目前对金葡菌的主要致病机理尚不十分清楚。另一方面，microRNA(miRNAs)可在转录水平微调基因的表达，在细胞的增殖分化、生长发育方面发挥重要作用，然而，目前miRNA在奶牛乳房炎发生中的作用的相关报道也较少。.本项目以奶牛乳腺上皮细胞、牛奶以及引起奶牛乳房炎的致病金黄色葡萄球菌为研究对象，通过构建miRNA文库和Solexa技术对miRNA进行高通量测序和生物信息学分析，研究了金葡菌感染前后牛奶和牛奶来源外泌体中miRNA的种类以及表达量的变化，在金葡菌感染前后外泌体miRNA的表达量有显著差异的有37种，可能参与细胞中的生物过程、分子功能和细胞成分的组成以及细胞中信号通路等方面。通过对牛奶三种组分的研究发现，与牛奶乳清和牛奶中体细胞相比，牛奶乳脂成分中的miRNA表达谱与乳腺组织的miRNA表达谱更类似，可以用于miRNA的分子靶标。此外，预测得到了奶牛乳腺组中的184种lincRNA，并且主要在防御反应、RNA的磷酸二酯键水解、核酸内切酶和cAMP介导的信号转导过程中发挥作用。另一方面，我们还深入探讨了在金葡菌抗性转移过程中起到关键作用的新型盒装染色体元件（SCC）：我们首次发现了一种新型Ccr重组酶CcrC2；我们还证实了在抗生素刺激下，Ccr重组酶介导的SCCmec的切除是通过激活SOS系统通路实现的，所有能够激活耐甲氧西林葡萄球菌中SOS反应的环境因素都能促进SCCmec的转移。最后，我们探索了抗菌肽与传统抗生素相比在治疗金黄色葡萄球菌中的优势，发现抗菌肽MP1102和NZ2114在体内和体外均能有效杀灭引起乳房炎的金黄色葡萄球菌。.综上所述，本项目的研究结果为进一步明确金葡菌引发的乳房炎的发病机制，以及奶牛乳房炎发病的miRNA鉴定标准提供了理论和实验基础，并为研发防治奶牛乳房炎的新型非抗生素类药物提供了可行性支持。