NKT样细胞亚群抗肿瘤作用及其机制研究

As a special T cell subset expressing NK cell receptors, NKT cells play essential roles in tumor immunity and development of auto-immune diseases. It has been published that type I NKT cells had antitumor effects in vitro and in vivo, which could be activated by α-Galcer, a potential antitumor drug. In our studies, we established a method to amplify antigen specific NKT-like cells in vitro, and found that the amplified MHC-I molecule restricted NKT subsets bore more potent antitumor capacities. These NKT-like cells express αβTCR, CD3, NK1.1, DX5 and CD8 molecule, but could not bind to α-Galcer loaded CD1d Tetramers. They contain a large number of functional granules in their cytoplasm, which may involve in direct tumoricidal activity against many kinds of tumor cells. They have both antigen specific and unspecific cytotoxicities against tumor cells, like CTLs and NK cells, respectively, which have not been reported yet. It was shown that adoptive transference of NKT-like cells could inhibit lung metastasis of B16-F10 melanoma cells in mice. This subject aims to explore the mechanisms of antigen specific and nonspecific antitumor effects by NKT-like cells, so as to lay the groundwork for the biological characteristics and antitumor therapuetic potential of human NKT-like cells.

NKT细胞是表达NK细胞标志的一类特殊T细胞群，在抗肿瘤、自身免疫病的发生中具有重要作用。目前已证实Ⅰ型NKT在体内外具有确切的抗肿瘤作用，其特异性激活物α-Galcer可能成为新的抗肿瘤药物。本课题组发现NKT中的MHC-I限制性NKT样细胞亚群具有更显著的抗肿瘤活性，并创立了NKT样细胞的体外扩增方法。NKT样细胞表达αβTCR,CD3,NK1.1,DX5,CD8，不与CD1d四聚体结合，胞浆内含有丰富的功能性颗粒，对多种肿瘤细胞有直接杀伤作用，并具有NK细胞的非特异性和CTL的抗原特异性双重杀伤活性，目前国际上尚未有类似的报道。体内抗肿瘤实验发现，NKT样细胞过继回输治疗能有效抑制小鼠黑色素瘤高转移株B16-F10肺转移灶的形成。本项目拟对NKT样细胞的非特异性和特异性双重抗肿瘤效应机制进行深入探讨，以期为研究人的NKT样细胞的生物学特性及抗肿瘤免疫治疗奠定研究基础。

NKT细胞同时表达TCR和NK标志，是一群重要的免疫细胞，研究发现其在抗感染、抗肿瘤和自身免疫病的发生中具有重要的作用。受MHC-I限制，带有NK标志和广谱TCR的NKT亚群（NKT样细胞），占总NKT细胞的40%，由于缺乏有效的细胞扩增手段，至今仍是免疫学领域和肿瘤学研究领域的空白点。本项目通过在体外添加抗原，成功扩增出CD8dim NKT细胞，其TCR谱具有多样性，属于NKT样细胞。研究发现CD8dim NKT细胞能够在体外杀伤多种肿瘤细胞，具有非抗原特异性抗肿瘤效应。进一步研究表明， CD8dim NKT细胞具有NK细胞类似的抗肿瘤相关颗粒释放途径，并且释放的颗粒能在体外杀伤肿瘤细胞，提示此为其非特异性抗肿瘤效应的机制。通过在以上NKT细胞培养体系中加入特异性的内源性抗原，成功扩增出CD8+NKT细胞。通过体外和体内过继回输实验证明，该群细胞具有抗原特异性和非特异性抗肿瘤能力。通过活细胞工作站观察，发现CD8+NKT细胞对B16-GFP细胞的杀伤能力显著强于NK细胞和CTL细胞。通过表达分析和基因芯片手段检测，发现相比NK、CTL细胞，CD8+NKT细胞高表达颗粒释放相关分子，其中尤以Granzyme B的高表达最为显著。进一步通过对NKT细胞的Granzyme B分子和B16细胞进行不同的荧光标记后，利用共聚焦显微镜观察CD8+NKT细胞杀伤肿瘤细胞的过程，发现CD8+NKT杀伤肿瘤细胞的效应依赖于穿孔素-颗粒酶途径。通过将MDSCs与OVA特异性的CD8+NKT样细胞或CTLs共培养，流式细胞仪分析计数MDSCs细胞存活率，表明CD8+NKT样细胞能比CTLs更有效地杀伤MDSCs，并且其杀伤效应具有抗原特异性。