赶山鞭内生真菌土曲霉的次生代谢产物中抗AD活性生物碱及其作用机制研究

Plant Endophytic fungi, new microorganism resources with the ability to produce various bioactive substances, are also easy to control and culture with a rapid growth and reproduction and improved by epigenetic regulation, which have great research value and a bright prospect in exploitation. In the previous studies, preliminary chemical investigation of Aspergillus terreus isolated from Hypericum attenuatum resulted in the identification of two alkaloids with novel skeletons under the guidance of anti-AD bioactivity, which revealed potential inhibitory activity against β-secretases. DNA methyltransferase (DNMT) inhibitors, an important tool of epigenetic manipulation, could enhance secondary metabolite production in A. terreus. In our further studies, the secondary metabolites of A. terreus cultivated in solid medium under general condition and the optimized conditions with the reasonable presence of DNMT inhibitors will be investigated systematically in order to obtain more new compounds with intresting structures and good bioactivities. A variety of spectral data, chemical conversion and X-ray single crystal diffraction will be used to determine the structure and the absolute configuration of.compounds. The inhibitory activity of isolated compounds against the formation of Aβ-protein of N2a-APP cells will be evaluated for their anti-AD activities, and the mechanism of promising compounds will be probed by the signal pathways of PPARγ-BACE1 and NF-κB-BACE1. In general, our objective is to explore secondary metabolites of A. terreus with novel structures and strong inhibitory activity against Alzheimer's disease.

植物内生真菌是一类新的微生物资源, 能够产生多种生物活性物质,同时又具有微生物易培养、易控制, 生长繁殖迅速等优点, 并可以通过表观调控等手段改良菌种性能, 具有重大的研究价值, 开发前景广阔.在活性追踪指导下，前期研究中我们从赶山鞭内生真菌土曲霉的固体发酵物中分离得到两个具有BACE1酶抑制作用的新骨架类型生物碱。本项目拟应用优化的甲基转移酶抑制剂组合干预土曲霉发酵并优化培养条件，使土曲霉产生更多结构新颖、抑制BACE1强的次生代谢产物。对土曲霉普通培养基扩大发酵和DNMT抑制剂干预的优化条件的次生代谢产物进行进一步研究，分离纯化得到单体化合物。综合利用多种波谱数据、X-单晶衍射和化学转化等方法解析分离得到的单体化合物的结构并确定绝对构型。运用N2a-APP细胞模型评价单体化合物的抗AD活性，选取活性优良的化合物从PPARγ-BACE1和NF-κB-BACE1信号通路研究其作用机制。

植物内生真菌是一类新的微生物资源, 能够产生多种生物活性物质,开发前景广阔。因此，本课题对赶山鞭内生真菌土曲霉的固体发酵物乙酸乙酯提取部位的化学成分进行了系统的研究，通过综合运用多种分离技术和波谱分析手段分离并鉴定了68个化合物的结构（新化合物31个），包括7个倍半萜类化合物，7个生物碱类化合物，29个杂萜类化合物，其中化合物1-6为罕见的具有α,β-unsaturated ketone unit的倍半萜，化合物15-20为首次发现的含有3,5-dimethylorsellinic acid-based meroterpenoids结构的萜类化合物，化合物29, 30, 和34为首次发现的3,5-dimethylorsellinic acidbased meroterpenoids possessing cis-fused A/B rings。. 课题组对得到的化合物生物活性研究表明新化合物15-20均具有较好的BACE1和AchE抑制作用，化合物15-20对BACE1抑制作用的IC50值为5.86‒27.16 μM，化合物15-20对AchE抑制作用的IC50值为22.18‒32.51 μM，同时也发现化合物15-20对GSK-3β和PP2A无调节作用，提示化合物抗AD活性的靶点可能为BACE1和AchE。化合物29，30和34均具有较好的BACE1抑制活性，IC50值分别为3.3、5.9和31.7 μM，但均劣于礼来公司阳性药（LY2811376；IC50值为0.62μM）。抗肿瘤活性研究表明：化合物1表现中等细胞毒活性，1对HL-60及SW-480的IC50值分别为15.3 μM，和25.7 μM。抗炎活性测试结果显示：化合物1和5在40μM浓度下，其NO抑制率分别为47.7%和37.3%。. 本研究对土曲霉的次生代谢产物进行了系统的研究，结果显示其含有大量的杂萜、倍半萜及生物碱类化合物，其中的9个新化合物对BACE1具有较显著的抑制活性，6个新化合物对AchE具有一定的抑制活性，可能开发成新的抗阿尔兹海默病的BACE1/AchE双靶点抑制剂。