拟南芥根系有毒离子胁迫应答相关的顺式调控元件的挖掘与鉴定

The expression and regulation of eukaryotic genes is a research hotspot and frontier in molecular biology. Promoter is crucial at the level of transcription regulatory, and transcription of specific gene expression is induced by the cis-regulatory elements and transcription factor binding. It is pivotal to understand the mechanisms of gene expression and regulation, and to master the methods of synthetic promoter for the resistance/tolerance plant breeding. The promoters in one or several genes are studied and large or new cis-regulatory elements related to stress response could not be comprehensive analysed in traditional study method. The effective experimental method will be established through a set of analysis by microarray data to the excavation of functional cis-regulatory elements and Arabidopsis thaliana will be used as experimental material in this project. It will be helpful for application in other plant. The complex transcriptional regulatory network structure for plant stress response from the promoter will be expatiated based on amount of functional cis-regulatory elements related to stress response. It will provide a powerful tool for the resistance/tolerance plant breeding.

真核基因的表达和调控是分子生物学研究的热点和前沿，而启动子在转录水平上的调节作用至关重要，它通过其中的顺式调控元件与转录因子结合后，诱导特定基因的转录表达。了解基因表达调控机理，掌握人工合成启动子的方法，对于未来的抗（耐）性植物育种研究具有重要的意义。传统的研究方法只局限于某一个或者几个基因的启动子的研究，不能综合分析与胁迫相关的崭新的、大量的顺式调控元件。本项目拟以拟南芥为实验材料，建立一套由生物芯片数据分析到功能顺式调控元件挖掘的有效实验方法。这将有益于在其他植物上的应用。确定大量的与胁迫应答相关的功能顺式调控元件，力求从启动子方面理解和阐述植物对胁迫应答的复杂的转录调控网络结构，为胁迫抗（耐）性植物的育种工作提供有力工具。

本项目从ARRAYEXPRESS database数据库中获得了拟南芥植物根系在Al3+, Cu2+, Cd2+, NaCl胁迫下的转录组数据(E-MEXP-1907)，经分析获得了不同胁迫中共诱导基因群。通过in silico分析获得了39个与胁迫应答相关的候选顺式调控元件序列。再经过共同出现频率计算获得了50个组合。针对以上39个候选顺式调控元件序列和50个组合，我们合成了人工启动子，插入到yy449 vector 序列的Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性内切酶的酶切位点之间，构建了含有不同人工合成启动子序列的89个重组质粒。用农杆菌转染拟南芥植物，获得89组转基因拟南芥植物。利用山本義治等人的方法，从每组转基因植物中筛选6株左右的单拷贝转基因植物，检测了不同胁迫中的荧光素酶报告基因的表达变化。主要成果包括：(1) 初步建立了一套由生物芯片转录组数据分析到功能顺式调控元件挖掘的有效分析方法。整个实验流程方面是可行的。(2) 适合分析不同胁迫下荧光素酶报告基因表达变化规律，并获得重复性高、结果稳定的重组质粒。在低pH胁迫处理条件下本项目中所使用的yy449质粒中的LUC报告基因未能提供重复性高、稳定的实验结果。为了攻克以上难题，我们购入了用不同生物来源的荧光素酶研发的质粒DNA。并用这些质粒中包含的荧光素酶报告基因替换yy449质粒中的LUC报告基因，构建了含有不同荧光素酶报告基因的重组载体。(3) 收集并分析了中国古老月季和软枣猕猴桃两种植物的种质资源之间的亲缘关系和遗传多样性，为后续人工合成启动子在其它植物中的具体应用做了准备工作。