猪miR-124调控clathrin介导的胞吞通路抑制乙脑病毒增殖的作用机制研究

Japanese encephalitis virus (JEV) causes damage to the central nervous system in human and reproductive disorders in pig, therefore, JEV leads to seriously harm to human health and pork industry. Little is known about the molecular mechanisms of host defense and resistance to JEV. Our previous study found that miR-124 inhibited the proliferation of JEV and its target gene DNM2 facilitated JEV proliferation, then we speculated that miR-124-DNM2 gene-clathrin pathway played an important role in the resistance to JEV infection. In this study, the miR-124 target genes related to clathrin-mediated endocytosis pathway will be identified through bioinformatics prediction and dual-luciferase reporter gene system, then the structure and number of clathrin coated pits will be calculated using transmission electron microscopy in miR-124 transfected cells, the roles of target genes in JEV proliferation will be also studied. The results will reveal the molecular mechanism of viral inhibition by miR-124. It can also provide a theoretical basis to design agents against JEV and pig disease-resistant breeding.

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起人的神经系统疾病及猪的繁殖障碍，严重影响人类健康和养猪业的发展。对宿主自身防御和抵抗JEV感染的分子机制研究十分欠缺。我们的前期研究发现miR-124能够抑制JEV增殖，且其靶基因DNM2对JEV增殖具有促进作用，推测miR-124-DNM2基因-clathrin胞吞通路在抵抗病毒侵入细胞过程中发挥重要作用。本研究拟通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因系统鉴定miR-124介导的clathrin胞吞通路的靶基因，利用透射电镜观察并统计miR-124对JEV感染后clathrin胞吞小窝结构和数量的影响，最后验证靶基因在抗JEV感染中所行使的调节作用，从而阐明宿主miR-124通过调控clathrin介导胞吞通路抗病毒感染机制，为进一步将miR-124作为乙脑病毒抗病毒制剂的研发和猪抗病育种提供理论依据。

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染能引起人流行性乙型脑炎和猪的繁殖障碍，对人类健康和养猪业发展造成严重影响。所以开展宿主抗JEV感染机制的研究显得尤为重要。本项目对miR-124抗JEV的机制作了系统研究。.项目执行期主要开展了以下研究：.（1）miR-124的抗病毒作用和靶基因筛选：在PK15细胞中过表达miR-124，再感染JEV，感染后24h，利用western blot和免疫荧光染色流式细胞术检测JEV的增殖情况，结果显示，和对照组相比，miR-124过表达后能显著降低JEV的感染，说明miR-124是一种抗JEV感染因子。为了阐明miR-124的抗病毒感染机制，利用靶基因在线预测软件预测miR-124的靶基因，进一步研究发现预测到的靶基因富集到胞吞通路中，而JEV是通过clathrin介导的胞吞进入细胞，所以选择clathrin介导胞吞通路中的关键靶基因DNM2和HIP1基因进行双荧光素酶报告基因实验验证，发现miR-124靶向DNM2基因而不靶向HIP1基因，然后通过QPCR和western blot分析发现，过表达miR-124均能够显著降低DNM2基因的mRNA和蛋白表达，说明miR-124靶向DNM2基因。.（2）DNM2基因促进JEV增殖：为了研究DNM2基因在JEV感染过程中的作用，针对DNM2.基因设计siRNA，将合成的siRNA转染PK15细胞，转染后感染JEV，感染36h后免疫荧光流式细胞术检测JEV增殖情况，发现敲低DNM2基因后，JEV的增殖受到了显著抑制，说明DNM2基因能够促进JEV的增殖。同时JEV感染后，不同时间点收集细胞提取总RNA和蛋白，qRT-PCR和western blot分别检测miR-124和dynamin-2的表达变化，结果显示，JEV感染后，miR-124和DNM2基因的表达呈现相反的趋势，其中miR-124表达升高，而DNM2基因的表达降低，进一步证明了DNM2基因是miR-124的靶基因。同时本研究还对调控JEV增殖的候选基因ADAM10进行了克隆和组织表达谱分析。.以上研究结果表明miR-124通过靶向clathrin介导的胞吞通路上的关键基因DNM2抑制JEV增殖，研究结果为抗JEV药物筛选提供新的靶标，也为抗病育种提供了新的思路。