长角血蜱孤雌生殖种群卵黄发生及其调控

蜱类是专性吸血的外寄生动物，传播多种人、畜疾病且具极强的繁殖力，对人类健康和畜牧业造成极大危害，在虫媒疾病中由蜱传播的病原体种类最多。蜱类生殖生理学是国际上研究的热点领域，其中卵黄发生及其调控是该领域的核心内容。本研究以长角血蜱Haemaphysalis longicornis孤雌生殖种群为研究对象，运用生物化学、分析化学、蛋白质组学、免疫学、高效液相色谱和气相色谱/质谱等现代生物学及其交叉学科的研究方法，在课题组前期对长角血蜱两性生殖种群卵黄发生深入研究的基础上，对其孤雌生殖种群卵黄蛋白(Vitellin, Vn)的理化性质、氨基酸组成与序列分析、卵黄原蛋白（Vitellogenin,Vg）合成组织定位与合成分泌动态、卵黄发生调控等进行研究，并与两性生殖种群卵黄发生进行比较，深入阐明长角血蜱卵黄发生及其调节机理，对于揭示蜱类生殖生物学规律、生理适应对策和调节机制具有重要意义。

蜱类生殖生理学是研究的热点领域，其中卵黄发生及其调控是该领域的核心。本研究以长角血蜱孤雌生殖种群为对象，在纯化出其卵黄蛋白（Vn）基础上，对Vn的性质、Vg合成分泌动态以及卵黄发生的调控进行了系列研究，对于揭示蜱类生殖生物学规律、适应对策和蜱的防治具有重要的科学意义，主要研究结果如下：长角血蜱孤雌生殖种群的Vn为血红素糖脂蛋白，等电点5.4，分子量370 KD，由9个亚基组成；GC/MS分析显示，Vn含2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸丁辛酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、邻苯二甲酸二异丁酯、14-甲基-十五酸甲酯和油酸甲酯7种脂类，含甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、山梨糖、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺9种糖类。用Vn免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经3次克隆化筛选，获得7株能稳定分泌抗Vn的单克隆抗体，即1F6、2H6、3A9、4G11和4H1，5G11和6G2。1F6和3A9亚型为IgG2a，2H6，4G11，5G11，6G2亚型为IgG2b，4H1亚型为IgG1。7株单克隆抗体均具有高度特异性，选取效价和特异性最好的1株抗体4G11进行亲和力测定，测得4G11重链和轻链的分子量分别为55.8 KD和20.9 KD，亲和常数（Ka）为4.6×107。采用双抗体夹心ELISA测定各时期脂肪体、血淋巴和卵巢中Vg或Vn的含量。结果表明，中心脂肪体和外周脂肪体均合成Vg，分别在饱血后4天和产卵后2天达到高峰，血淋巴和卵巢中Vg/Vn在产卵后2天含量最高。显示Vg由脂肪体合成，释放到血淋巴，由发育中的卵母细胞选择性摄取、加工成Vn，作为胚胎发育的营养源。蜕皮激素调控长角血蜱孤雌生殖种群的卵黄发生，但依蜱的发育期而不同。吸血期（吸血后3-5天）注射0.5、1.0μg /g（体重）剂量的20-E显著提高Vg合成量，对Vg的合成与释放有调节作用，其他剂量无作用；20-E对饱血期蜱（饱血当天）的卵黄发生无作用。保幼激素JH Ⅲ对卵黄发生无作用。从长角血蜱生殖附腺中发现一种新型防御性抗菌多肽，命名为HIMS-defensin，HIMS-defensin基因全长349bp，是编码79个氨基酸组成的多肽，具有明显的抗菌活性。