SETDB1蛋白调控ES细胞命运的结构和功能研究

SETDB1 is an epigenetic regulator and plays a key role in ES cell fate determination. It is a histone H3K9 methyltransferase and belongs to the SUV39 subfamily. We use X-ray crystallography to study the structural biology of SETDB1 protein and its interaction partner: (1) structural determination of the Tudor, MBD and SET domain of SETDB1; (2) identification of the interaction network of SetDB1 and its interaction partners, such as KAP1, CAF-1, MBD1 and DNMT3a; (3) structural determination of SETDB1 in complex with its binding partner; (4) functional studies and in vivo assay of the interactions between SETDB1 and its binding proteins in ES cell differentiation and maintenance. Our result will demonstrate the relationship between DNA methylation and histone H3K9 methylation in transcriptional silencing and the function of SETDB1 in ES cell fate determination, and provide the structural insights into the molecular mechanism of ES cell development as well as the therapeutic targets for some disease.

SETDB1是决定细胞命运的一个表观遗传调控蛋白，属于H3K9甲基转移酶SUV39亚家族。本申请项目将运用结构生物学方法研究：（1）SETDB1蛋白的tudor结构域、MBD结构域和SET结构域的结构解析；（2）SETDB1蛋白与KAP1、CAF-1、MBD1、DNMT3a等蛋白的相互作用关系；（3）SETDB1蛋白与这些相互作用蛋白形成的复合物的晶体结构解析；（4）体内实验验证这些相互作用，以及SETDB1蛋白在调控基因表达和维持ES细胞未分化状态的功能。阐明DNA甲基化和组蛋白H3K9的甲基化修饰对于基因转录沉默的关系和功能，以及SETDB1蛋白在ES细胞分化与维持不分化的命运决定中的功能，对于揭示ES细胞发育的分子机制提供结构基础，也为一些疾病的治疗提供了分子标靶。

本项目在piRNA通路中SETDB1相关蛋白的研究取得了一些进展和结果。转座子元件是人类基因组的最大组成成分。转座子又被称为“跳跃基因”，它可以从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。转座子移动的特性对基因组的完整性和稳定性造成巨大的危险，特别在生殖细胞中，由于其担负着遗传信息由亲代传递给子代的重要任务，转座子的表达需要被严格地调控。因此有机体进化出一种类似于RNAi方式的免疫反应来沉默转座子元件。piRNA是一类在动物生殖谱系细胞中专一性表达的小分子非编码RNA，与PIWI蛋白结合后，通过沉默转座子，保证生殖细胞基因组的稳定性，在配子形成（精子和卵子发生）过程中发挥重要作用，Piwi蛋白和piRNA的缺失或失调会引起不育。其中，SETDB1被报道在体内行使功能需要mAM/CAF1的参与。我们共表达了果蝇SETDB1和mAM在果蝇中的同源蛋白eggless和wde的片段，通过酵母双杂实验验证了它们之间的相互作用并解析了wde蛋白的coiled-coil结构域结构，该结构域以自身的二聚体形式存在，并与SETDB1相互作用。eggless在果蝇piRNA的生成加工及沉默转座子的通路中还起着重要作用。研究表明eggless蛋白是piRNA生成所必须的。而eggless的下游蛋白Rhino能特异性地识别果蝇生殖细胞中的dual-strand piRNA cluster，从而引起PolII转录出前体piRNA。而Rhino是HP1的同源蛋白，通过识别piRNA簇上的H3K9me3的标记起作用。我们表达纯化了Rhino蛋白的chromodomain结构域，获得并解析了其与H3K9me3的复合物结构。发现该chromodomain相对于其他HP1的chromodomain有3个结构特点：a、它能形成homodimer；b、C端的螺旋较长；c、能同时结合两条呈反平行方向的H3K9me3肽段。经过ITC、蔗糖梯度离心、转基因果蝇等实验，我们验证了Rhino蛋白的chromodomain二聚体的形成是Rhino蛋白发挥功能所必须的。该结果已在国际期刊Cell Research （2015）上发表，并受邀在Oncotarget（2015）上撰写社论。.