Shh-Nfic信号通路在骨样牙本质形成中的作用研究

骨样牙本质在牙外伤、再植、再生等情况下形成，是常见牙髓硬组织形成类型，但调控机制不明。最近发现，Nfic基因缺陷可形成骨样牙本质，而上皮根鞘中Shh可能是牙乳头细胞Nfic上游基因。我们前期发现，根发育阶段牙胚移植后，Shh、Nfic表达异常，并形成骨样牙本质，因此假设Shh-Nfic信号调控骨样牙本质形成，可能从细胞增殖、分化、尤其是细胞连接形成和基质有序分泌等方面影响成牙本质细胞分化。本课题拟通过体内实验和组织学方法观察实验性骨样牙本质形成过程中Shh-Nfic的表达；体外细胞培养/共培养、RT-PCR、Western blot等手段研究上皮根鞘和牙乳头干细胞共培养中该通路的调控，以及通过基因转染、RNA干扰等方法研究Nfic对牙乳头干细胞分化方向的调控；最后行体内实验验证Nfic对牙乳头干细胞形成牙本质性状的影响，以探讨骨样牙本质形成机制，为牙本质形成、修复和再生研究提供新思路方法。

牙齿在深龋、外伤、再植、牙髓切断术、移植等临床和基础研究条件下，牙髓通常会以形成骨样牙本质的方式再生。骨样牙本质中成牙本质细胞发育异常，失去细胞间连接、成为分散独立的圆形细胞，并包埋于自身快速分泌的基质中，类似骨基质，与牙本质在组织结构上不同，其强度功能也相异。Shh-Nfic信号在上皮根鞘细胞调控牙乳头间充质干细胞的分化、成牙本质细胞的形成中具有重要作用。本课题通过体内实验建立了骨样牙本质形成的实验动物模型，通过组织学方法观察到Shh-Nfic在骨样牙本质形成过程中的表达规律；体外细胞培养/共培养、RT-PCR、Western blot等手段研究了Shh-Nfic信号在上皮根鞘对牙乳头干细胞分化的调控作用；并通过体内实验观察了Nfic对牙乳头干细胞膜片再生出牙本质的性状特点。本课题成功建立了稳定形成骨样牙本质的动物实验模型，填补了该领域的空白，使我们能够深入研究探讨骨样牙本质这一临床和基础研究中常见现象的形成机制。与正常发育对照组相比，在骨样牙本质形成过程中，Shh、Nfic表达均为阴性，表明其消失与骨样牙本质的形成密切相关。体外实验成功分离培养了HERS细胞和牙乳头干细胞。牙乳头干细胞作为牙髓干细胞的前体，具有更加旺盛的增殖能力、克隆形成能力、以及多向分化潜能，提示其作为种子细胞，在牙髓组织、牙本质-牙髓复合体、以及骨再生中的应用前景非常广阔。牙乳头干细胞的来源丰富，如临床上拔除的发育未完成的多生牙、阻生第三磨牙和正畸治疗需拔除的年轻恒牙等。通过模拟发育微环境，建立了上皮-间充质细胞共培养体系，对牙乳头干细胞的定向（成牙）分化具有至关重要的作用，可能也是生理性管样牙本质再生的一个关键的前提条件。在Hertwig's上皮根鞘细胞产生的Shh信号的刺激下，牙乳头干细胞产生下游因子Nfic，通过自分泌或/及旁分泌途径，刺激成牙本质细胞的分化和形成。体内种植实验观察到牙乳头干细胞膜片在牙本质基质支架材料表面形成了无定形的矿化基质。本项目的研究结果为牙本质的形成、修复和再生研究提供了新的研究思路和方法。